Rap2b在p53突变的肿瘤细胞中的功能研究

发布时间：2020-04-02 04:53

【摘要】：肿瘤抑制基因p53在肿瘤的发生及发展过程中发挥着极其重要的作用。作为突变频率最高的抑癌基因之一,p53在50%以上的人类肿瘤中发生突变,并在肿瘤细胞内维持较高水平。Rap2b是Ras癌基因超家族和p53的新靶基因,在大多数肿瘤细胞中高表达。我们推测,肿瘤细胞中较高水平的突变p53蛋白仍在一定程度上保留了对Rap2b的诱导能力,因而表达较高水平的Rap2b,从而促进肿瘤细胞的存活。本研究旨在探讨Rap2b在p53突变的肿瘤细胞中的功能、Rap2b表达水平与p53突变之间的关系及其可能的分子基础,为深入理解Rap2b和p53在肿瘤细胞发生发展过程中的作用提供重要实验依据。首先,本研究参照UMD数据库中各种肿瘤的p53热点突变资料,选择46个突变位点和突变方式,设计一系列p53突变引物构建p53突变体,转染重组质粒至HCT116(p53-/-)细胞,并利用免疫印迹法检测突变体的表达情况。结果显示,31个p53突变体在该细胞中存在高水平表达。接着,选取能成功表达p53突变体的质粒包装慢病毒,感染人结直肠癌细胞HCT116(p53-/-),经抗生素筛选后,获得稳定表达各种p53突变体的细胞株。利用免疫印迹法检测Rap2b和p53的表达水平,以揭示不同p53突变体与Rap2b表达水平之间的关系。结果表明,p53某些位点的突变能提高肿瘤细胞内Rap2b的蛋白水平。然后,选取两个代表性的p53突变(p53R175H和p53R273H)细胞株,稳定敲低细胞内Rap2b的表达水平,观察Rap2b的敲低对p53突变肿瘤细胞株生长速率、迁移能力、致瘤性、阿霉素处理前后细胞周期和细胞凋亡的影响。结果表明,Rap2b敲低后p53突变肿瘤细胞的生长速率、致瘤性和细胞迁移能力显著降低,但是对细胞凋亡和细胞周期没有明显影响。最后,为探明p53突变肿瘤细胞表达高水平Rap2b蛋白的原因,我们研究了在p53野生型和突变型肿瘤细胞中调控Rap2b表达方式的差异。通过用Nutlin-3处理p53野生型及突变型肿瘤细胞,并在撤除Nutlin-3后的不同时间点用免疫印迹法检测p53和Rap2b的蛋白水平,我们发现在p53突变的肿瘤细胞中,p53突变体蛋白在Nutlin-3撤除后仍在较长时间范围内维持较高水平,并且p53在不同程度上丢失了对某些靶基因如p21的诱导作用,但仍然能诱导一些靶基因如Rap2b、Hdm2、Bax和Puma等的表达。我们还通过Pulldown实验发现,p53的突变严重阻碍p53与Rap2b的直接结合。综上所述,本研究揭示p53突变通过显著提升肿瘤细胞中p53突变体蛋白的稳定性,使肿瘤细胞中的Rap2b蛋白维持在较高水平,从而促进肿瘤细胞的生存。这一发现对于制定有效的人类癌症治疗策略具有重要意义。
【图文】：

超过９５％的错义突变发生在ＤＢＤ区，尽管该区域的每个氨基酸都能发生突变，但是逡逑以下几个位点的突变在癌症中则相对频繁，并与癌症发生紧密关联，因而被称之为热点逡逑突变，这几个突变位点分别是：Ｒ１７５、Ｇ２４５、Ｒ２４８、Ｒ２４９、Ｒ２７３、Ｒ２８２邋（图１－１）。逡逑ｐ５３突变大体上可以分为两种：移除了基本的ＤＮＡ作用位点的ＤＮＡ接触突变（致使ｐ５３逡逑与ＤＮＡ结合的能力减弱）和扰乱了邋ｐ５３功能域的结构突变，最终减弱了它的动力学和热逡逑力学稳定性（Ｃｈｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９４；邋Ｆｒｉｅｄｌｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００３）。逡逑１．２．２突变ｐ５３特性逡逑１．２．２．１突变ｐ５３的半衰其月逡逑突变ｐ５３为了执行其功能，在癌细胞中的高水平表达是其功能性获得的重要一步，其逡逑半衰期也得到普遍的延长（１－２４ｈ），而野生型ｐ５３蛋白的半衰期则被严格控制，通常只有１０逡逑ｍｉｎ左右。对于这一现象，有研宄发现，癌细胞中ｐ５３突变蛋白在细胞中的定位更加广泛逡逑（Ｓｏｕｓｓｉ，邋２００５；邋Ｍｏｒｓｅｌｌｉ邋ｅｔａｌ．，邋２００８），这表明ｐ５３突变蛋白在核质间的穿梭能力降低，使ｐ５３逡逑突变蛋白被ＨＤＭ２泛素化修饰并降解的机会降低。另有研究表明，在ｐ５３突变的细胞中，逡逑ｐ５３与ＨＤＭ２／ＭＤＭ２这一负反馈机制受到限制（Ｙｕｅｅｔａｌ．

（Ｍａｒｉｄｏｎｎｅａｕ邋ａｎｄ邋Ｄｅ，邋１９９２），多个研究均己证明Ｒａｐ２ｂ在细胞癌变时表达量增加（Ｄｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１５；邋Ｚｈａｎｇ邋ｅｔａｌ．，邋２００７），进而推定该蛋白可能加速细胞致瘤并是一个癌基因。另外，最逡逑新的ＧＥＰ丨Ａ数据库统计结果显示Ｒａｐ２ｂ在多种肿瘤组织中呈现高表达（图１－４）。逡逑３0邋１逡逑＾２５邋■逦■ＴＵｍ0ｒ逡逑■邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑ｍ逡逑Ｚ邋２０邋－逡逑ｌ１５逦Ｉ逡逑图１－４邋Ｒａｐ２ｂ在多种肿瘤组织中呈现高表达。数据来自最新ＧＥＰＩＡ数据库。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｒａｐ２ｂ邋ｉｓ邋ｈｉｇｈｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｉｎ邋ａ邋ｖａｒｉｅｔｙ邋ｏｆ邋ｔｕｍｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ｄａｔａ邋ｃｏｍｅ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｌａｔｅｓｔ邋ＧＥＰＩＡ逡逑ｄａｔａｂａｓｅ．逡逑Ｒａｐ２ｂ作为一个小ＧＴＰａｓｅ，，在鸟苷酸交换因子（ＧＥＦ）作用下（ＧｕｉｄｅｔｔｉａｎｄＴｏｒｔｉ，逡逑２０１２），１＾卩２１？通过结合0丁？而激活，而在0丁？＆５６激活蛋白（0八？）作用下（0代（；（＾１３１．，逡逑２００６），邋Ｒａｐ２ｂ邋结合邋ＧＤＰ邋而失活。ＧＥＦ邋主要包括邋ＰＤＺ－ＧＥＦｓ、Ｅｐａｃｌ、ＣａｌＤＡＧ－ＧＥＦ、逡逑Ｃｒｋ、Ｃ３Ｇ等，ＧＡＰ主要包括ＲａｐＧＡＰ、Ｅ６ＴＰ１、ＳＩＰＡ１。在许多胞外激活剂及胞内信号逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.2

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