防御素2联合水泡口炎病毒基质蛋白抗结肠癌研究

发布时间：2020-04-02 19:36

【摘要】：实验目的:β-防御素2(MBD2)是防御素家族的重要成员,是天然免疫的重要分子,在获得性免疫和天然免疫中具有桥梁作用。可通过免疫趋化,诱导树突状细胞(DC)成熟增强机体的抗肿瘤免疫。水泡口炎病毒的基质蛋白(VSVM)是水泡口炎病毒的组成蛋白之一,是VSV病毒诱导肿瘤细胞裂解的关键分子,VSVM在诱导肿瘤细胞凋亡的同时还能抑制肿瘤血管的生长、激活细胞免疫反应。基于此,我们推测MBD2与VSVM共同表达时,MBD2可通过免疫趋化,诱导树突状细胞成熟增强VSVM诱导的机体免疫抗肿瘤效应。为此,研究拟构建VSVM和MBD2真核表达载体p VSVM、p MBD2及VSVM与MBD2的共表达载体p VITRO2-VSVM-MBD2,通过上述各表达载体对小鼠结肠癌细胞CT26、小鼠结肠癌异种移植瘤生长的影响探究MBD2联合VSVM在结肠癌治疗中的作用。实验方法:将MBD2与VSVM基因克隆至p VITRO2载体中,获得p VSVM、p MBD2和p VSVM-MBD2三个真核表达质粒。体外细胞实验研究,利用Lip2000转染结肠癌细胞CT26细胞,通过MTT法观察细胞增殖抑制率,PI荧光染色、Annexin V-PE/7-AAD双染法检测细胞凋亡率;利用DC细胞趋化能力观察各质粒转染CT26细胞上清中MBD2的活性。在体内实验中,建立了BALB/c小鼠结肠癌(CT26)肿瘤模型,将荷瘤小鼠随机分为组6组:p VSVM组,p MBD2组,p VSVM+p MBD2双质粒组,p VSVM-MBD2组,Lip2000组,PBS组。将p VSVM,p MBD2,p VSVM+p MBD2,p VSVM-MBD2,p VITRO2分别与Lip 2000按比例配置成工作液,采用瘤内注射法注射于各小鼠移植瘤内,PBS组仅注射PBS溶液。按上述方法每3天注射一次,连续注射6次;治疗后比较各组小鼠体内肿瘤结节的体积,观察小鼠的生存时间及毒副反应。实验结果:重组质粒p VSVM、p VSVM-MBD2和p VSVM,p MBD2双质粒转染CT26细胞后,均能抑制CT26细胞生长,促进凋亡,且具有一定的时间依赖性;与对照组比较,p MBD2转染组细胞的生长和凋亡无明显变化;p VSVM-MBD2重组质粒转染CT26细胞后其上清液诱导树突状细胞的趋化能力较p VSVM、脂质体转染组显著增加,但与p MBD2转染组细胞组无显著性变化;荷瘤小鼠模型中,p VSVM组,p MBD2组,p VSVM+p MBD2双质粒组,p VSVM-MBD2组其小鼠肿瘤的生长明显较PBS组及Lip2000组慢,且p VSVM-MBD2治疗组肿瘤生长速度最慢,荷瘤小鼠生存率高达70%以上,生存时间也较其它各组长。实验结论:1、研究通过体外细胞实验证实,p VSVM、p VSVM-MBD2质粒能够诱导肿瘤细胞凋亡。2、研究通过移植瘤模型的建立,证实p MBD2、p VSVM、p VSVM-MBD2与脂质体形成的复合物瘤能够抑制荷瘤小鼠实体瘤的生长。3、MBD2可通过免疫趋化诱导树突状细胞成熟增强VSVM诱导的机体免疫抗肿瘤效应。
【图文】：

质粒,产物

图 1 目的基因双酶切鉴定ITRO2-VSVM-MBD2 质粒酶切产物物；p-B，pVITRO2-MBD 质粒酶f the target gene. M,DNA marker; p

pGFP转染CT26细胞中GFP表达量评估
【学位授予单位】：延安大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.35

【参考文献】