肺癌中EMT核转录因子ZEB1的表达规律及对化疗敏感性的影响及机制的研究

发布时间：2020-04-03 01:00

【摘要】：肺癌是全球发病率居首的恶性肿瘤,由于缺乏高特异性早期诊断技术,发现时多出现周边组织侵犯或全身多发转移,直接导致患者治疗失败,失去有效缓解、改善预后的机会。因此,寻找理想的可以用于早期诊断肺癌的标志物或者分子靶点,深入挖掘肺癌组织侵袭和远处转移的相关分子机制,对肺癌的早期发现、规范有序的诊断分期、改善预后等具有重要的临床意义。EMT发生的重要标志是E-钙粘蛋白,细胞角蛋白,闭合蛋白等上皮表型的减少或缺失,以及波形蛋白、N-钙粘蛋白等间质表型的转化及增强。上皮E-钙粘蛋白(E-cadherin,EC)的表达下降亦或缺失,肿瘤细胞组织侵袭能力更强,同时其远处转移能力也将变得更强。研究人员指出:在肿瘤组织中,EC表达相对较低,这种情况尤其出现在淋巴结转移亦或是晚期低分化肺癌组织中。CD44是一种糖蛋白,具有多种生物学功能,在细胞-基质-细胞等特异性黏附中发挥着特定的作用,与肿瘤的侵袭、淋巴结转移以及临床预后关系密切。E-cadherin表达受到多种关键转录因子的调控,如ZEB2等。作为EC最重要的转录抑制因子,ZEB1的表达在诱导EMT的发生中起关键作用,ZEB1表达增高可直接或间接导致EC表达下调,使EMT的发生更为容易,从而增加肺癌等恶性肿瘤的迁徙、侵袭、抗凋亡等能力,对非小细胞肺癌患者复发转移分子机制研究有着十分关键的作用,同时对判断预后也有着十分关键的作用。现阶段其与肿瘤的关系备受关注,但关于ZEB1在非小细胞肺癌中的具体作用尚不清楚。鉴于ZEB1在调节EMT上的重要作用,研究ZEB1在非小细胞肺癌患者中的表达并分析其临床意义,可能会为非小细胞肺癌的治疗提供新的治疗策略。本研究对于我们更好地了解非小细胞肺癌的发生发展机理,探索非小细胞肺癌的有效治疗模式及指导用药等都具有特别重要的意义。鉴于上述原因,本项研究首先探讨了 ZEB1在103例非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,发现ZEB1在NSCLC组织中的表达均高于癌旁组织,且ZEB1表达与临床分期、淋巴结转移、肿瘤的分化程度相关。而且发现ZEB1蛋白的高表达与NSCLC的PFS相关,ZEB1蛋白的高表达是非小细胞肺癌预后不良的一个重要因素。在此研究基础上,我们进一步研究了低氧环境对肺腺癌细胞系A549细胞中ZEB1蛋白表达的影响规律,低氧对肺腺癌细胞系A549细胞化疗敏感性的研究,同时研究了采用ZEB-1特异性siRNA阻断ZEB1表达后肺腺癌细胞的化疗疗效变化规律,发现低氧使顺铂的化疗敏感性降低,ZEB1特异性siRNA转染后A549细胞对顺铂的化疗敏感性增加;我们的研究发现低氧可以诱导ZEB1在A549肺腺癌细胞中的表达,而低氧诱导的ZEB1高表达是其耐药的分子基础,经特异性siRNA阻断ZEB1的表达可以改善肺腺癌细胞体外化疗药物的疗效。提示ZEB1是NSCLC的重要分子标志物和治疗潜在靶点。第一部分ZEB-1、E-cadherin、CD44在非小细胞肺癌组织中的表达及临床病理因素的相关性目的探讨ZEB-1、E-cadherin、CD44在非小细胞肺癌组织中实现表达,研究其与临床病理因素之间的关联性。方法1.主要使用免疫组化法对103例非小细胞肺癌患者肿瘤组织中ZEB-1、E-cadherin、CD44表达进行详细的检测。2.对ZEB-1、E-cadherin以及CD44进行全方位的探讨,了解其与临床病理参数关联性。3.统计学处理:采用χ2检验分析EC、ZEB1和CD44的表达及其与各临床病理参数间关联性,本次研究将关联性分析应用到Spearman等级分析层面,同时使用Kaplan-Meier分析来对生存资料展开细致的分析,使用LogRank(Mantel-Cox)检验来展开生存率影响单因素分析;使用Cox回归来展开多因素分析。α=0.05作为检验水准。结果1.在NSCLC癌组织及癌旁组织中,ZEB1蛋白有着55%(57/103)以及19%(20/103)的阳性表达率,这意味着差异表现出显著的统计学意义(P0.001);CD44的阳性表达率分别为61.2%(63/103)、23.3%(24/103),这意味着差异表现出显著的统计学意义(P0.001);EC 则为 43.6%(45/103),90.2%(93/103),两者的阳性表达率的差异有统计学意义(P0.001)。三者在肺癌组织中的表达均与患者吸烟、年龄、肿瘤直径及病理分型无关,均与临床分期、淋巴结转移、肿瘤的分化程度相关,差异均有统计学意义(P均0.05)。2.Spearman等级相关分析指出,若ZEB1高表达,相对应的CD44就会高表达;ZEB1若高表达,相应的EC就会低表达,CD44与EC的表达之间存在负相关(r=-0.193,P=0.019)。3.ZEB1表达阴性组、低表达组和高表达组的平均PFS分别是18.66月、14.57月和7.93月,三组差别有统计学意义(χ2=27.849,P0.001)。ZEB1表达阴性组、低表达组和高表达组的平均5年生存时间分别是51.10月、45.13月和41.34月,三组生存曲线比较差异有统计学意义(χ2=5.967,P=0.015)。ZEB1表达、淋巴结转移、肿瘤的分化程度均是影响PFS的独立危险因素。结论1.ZEB1、CD44和E-cadherin在NSCLC组织中的表达均高于癌旁组织,三者表达均与临床分期、淋巴结转移、肿瘤的分化程度相关,差别均有统计学意义(P均0.05),ZEB1、CD44表达与NSCLC的恶性程度相关。2.ZEB1蛋白的表达与CD44的表达表现出一种正相关关系,而其与E-cadherin表达表现出一种负相关关系。这意味着ZEB1依托下调E-cadherin的表达,同时影响CD44的表达,促使EMT的发生发展。3.ZEB1阳性表达的NSCLC的PFS和5年生存率明显低于ZEB 1阴性表达的NSCLC患者,ZEB1的阳性表达是影响患者PFS的独立危险因素。提示ZEB1蛋白的表达阳性是非小细胞肺癌预后不良的一个重要因素。第二部分低氧对ZEB-1在肺腺癌细胞中的表达及其增殖和侵袭能力的影响及机制目的研究低氧对人肺腺癌A549细胞中ZEB1及其相关因子CD44和E-cadherin蛋白表达的影响规律,并且经过进一步的ZEB1特异性siRNA实验探讨ZEB1对肿瘤细胞的侵袭转移的影响及其作用机制。方法1.低氧实验:取肺腺癌A549细胞分别在常氧和低氧(3%)条件下培养,在倒置显微镜下观察其生长情况,采用Western blotting检测ZEB1,E-Cadherin及CD44在肺腺癌A549细胞细胞株的表达。2.ZEB1siRNA实验:采用构建的针对ZEB1基因表达的siRNA,经脂质体转染肺腺癌A549细胞,分别在常氧和低氧中培养一定的时间。在荧光显微镜下观察转染的细胞,以确定ZEB1siRNA质粒转染成功。在确认转染成功后进行下列实验:(1)Western blot检测转染前后E-Cadherin及CD44的表达情况。(2)噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖。(3)Transwell小室基质侵袭实验检测ZEB1对肺腺癌A549细胞侵袭能力的影响。(4)划痕损伤实验中,在一定程度上会干扰到肺腺癌A549细胞迁移能力,我们需要仔细的观察这种影响3.统计学分析:本文选用SPSS17.0,使用单因素方差分析,对比多组计量资料,使用LSD法来对比每两个组,本次研究中主要选用了 α=0.05作为检验水准。结果1.肺腺癌细胞A549培养环境主要有两种,一种是低氧的环境,一种是常氧的环境,本文研究展开了 Western blot检测,详细的结果具体如下:在低氧环境中,A549细胞培养24h,其对应48hE-Cadherin的表达均降低,ZEB1及CD44的表达增高(P0.05)。2.(1)在常氧和低氧的条件下,ZEB1特异性siRNA转染A549细胞后,CD44的表达均下降,E-Cadherin的表达增加(P0.05)。(2)ZEB1转染前后,对细胞增殖速度进行检测,本文主要选用了 MTT检测,结果具体如下,低氧组有着最快的细胞增殖速度,紧随其后的分别是常氧组以及低氧转染组,而细胞增殖速度最慢的为常氧转染组,这意味着差异表现出显著的统计学意义(p0.05)。(3)展开Transwell小室基质侵袭实验实验结果具体如下:常氧组在实验中对应的细胞穿膜数具体为(3549±643.9653),常氧转染组在实验中对应的细胞穿膜数具体为(1568±311.6294),低氧组在实验中对应的细胞穿膜数具体为(3983±985.8247),低氧转染组在实验中对应的细胞穿膜数具体为(2364±852.8745)个,这意味着差异表现出显著的统计学意义(P0.05)。(4)划痕损伤实验,相应的实验结果具体如下:常氧组在实验中对应的细胞24h迁移宽度具体为(352.6±108.123),常氧转染组在实验中对应的细胞24h迁移宽度具体为(229.4 ±85.267),低氧组在实验中对应的细胞24h迁移宽度具体为(572.8± 92.379),低氧转染组在实验中对应的细胞24h迁移宽度具体为(331.6± 26.796);常氧组在实验中对应的细胞36h迁移宽度具体为(674.4±45.258),常氧转染组在实验中对应的细胞36h迁移宽度具体为(331.8±65.279),低氧组在实验中对应的细胞36h迁移宽度具体为(836.6±94.298),低氧转染组在实验中对应的细胞36h迁移宽度具体为(485.4±121.096),差异有统计学意义(P均0.05)。结论低氧可以诱导人肺腺癌A549细胞中ZEB1的表达升高,同时伴发EMT,肿瘤细胞的迁移侵袭能力增强。siRNA阻断ZEB1的表达后可以逆转上述现象,进一步证明ZEB1促进人肺腺癌A549细胞增殖、侵袭和转移。第三部分ZEB-1对肺腺癌化疗敏感性的影响机制目的研究ZEB1对人肺腺癌细胞系A549细胞顺铂化疗敏感性的影响,以探讨ZEB1对肿瘤化疗抵抗中的作用机制。研究采用不同氧浓度下ZEB1表达的波动是否影响顺铂化疗的疗效,然后采用ZEB1siRNA技术进一步观察ZEB1对顺铂治疗的疗效的影响。方法1.MTT比色法检测各组细胞对顺铂的敏感性:取对数生长期的上述4组细胞按1×104/孔接种于96孔培养板,于培养24h后换液,分别加入顺铂(终浓度为3mg/L),培养24 h,每组设6个复孔,独立重复3次,另设阴性对照组(未转染的细胞,不加顺铂)。在酶联免疫测定仪上测定各孔吸光度A值。计算细胞生长的增殖率,增殖率=(实验组A平均值/对照组A平均值)×100%。2.对检测细胞周期和凋亡率变动进行检测,主要应用了流式细胞仪,过程具体如下:选择对数生长期的上述4组细胞,调整细胞浓度为2×105/ml接种于培养瓶,加入顺铂(终浓度3mg/L);另设阴性对照组(未转染的细胞,不加顺铂)。培养24 h后获取细胞,制成单细胞悬液,上机检测细胞凋亡率。3.使用SPSS17.0软件,使用单因素方差分析来对比两组以上的计量资料,使用LSD法来展开每两组之间的对比,同时选择了α =0.05为检验水准。结果1.转染ZEBlsiRNA对A549细胞顺铂化疗敏感性的影响MTT测结果显示:转染组A549细胞对顺铂化疗的敏感性明显增加,培养条件为常氧与低氧,对细胞增殖速度进行检测,本文主要选用了 MTT检测,结果具体如下,低氧组有着最快的细胞增殖速度,紧随其后的分别是常氧组以及低氧转染组,而细胞增殖速度最慢的为常氧转染组,这意味着差异表现出显著的统计学意义(P0.05)。转染组细胞与未转染组及阴性质粒组比较,差异均有统计学意义(P均0.05),未转染组与阴性质粒组比较,差异无统计学意义(P=0.256)。2.转染ZEB1siRNA后A549凋亡率的变化顺铂作用于末转染组、阴性质粒组及转染组后,各组细胞凋亡率均明显高于阴性对照组,差异均有统计学意义(P均0.01):转染组与未转染组及阴性质粒组相比差异均有统计学意义(P均0.05)。低氧组在实验中有着最低的凋亡率,紧随其后的分别是常氧组以及低氧转染组,实验中凋亡率最高的为常氧转染组,这意味着差异表现出显著的统计学意义(P0.05)。结论低氧使顺铂的化疗敏感性降低,ZEB1特异性siRNA转染后A549细胞对顺铂的化疗敏感性增加。提示ZEB1可能是NSCLC的重要分子标志物和增加化疗敏感性的潜在的治疗靶点。
【图文】：

腺癌,蛋白,细胞浆

３结果逡逑３．１邋ＮＳＣＬＣ组及癌旁组织中ＺＥＢ１、ＣＤ４４、ＥＣ的表达逡逑在细胞核或细胞浆中表达ＺＥＢ１蛋白，均染成棕色（图１．１Ａ、１．１Ｂ）；邋ＣＤ４４逡逑蛋白表达所对应的位置具体为细胞浆以及细胞核；ＥＣ蛋白表达所对应的位置具逡逑体为细胞膜以及细胞浆，染色也会出现在某些炎细胞中。对ＮＳＣＬＣ癌组织中逡逑ＺＥＢ１蛋白所对应的阳性表达率具体为５５％（５７／１０３），在癌旁组织中ＺＥＢ丨蛋白逡逑所对应的阳性表达率具体为１９％（２０／１０３），这意味着差异表现出显著的统计学逡逑意义；ＣＤ４４的阳性表达率分别为６１．２％邋（６３／１０３）、２３．３％（２４／１０３），这意味着差逡逑异表现出显著的统计学意义（Ｐ＜0．００１）；邋ＥＣ则为４３．６％（４５／１０３），９０．２％逡逑（９３／１０３），两者的阳性表达率的差异有统计学意义（户＜０．００１）。三者在肺癌组逡逑织中的表达均与患者吸烟、年龄、肿瘤直径及病理分型无关，均与临床分期、逡逑９逡逑

生存时,蛋白表达,统计学意义,差别

…０－邋＇逡逑°邋丨。Ｍ逦Ｍ邋５０邋Ｍ逦＾￣Ｓ￣５￣￣Ｓ￣￣Ｉ￣５￣￣Ｓ－１逡逑Ｔ？ｎ？＿ｎ＞逦Ｔｎｗｍｏｎｌａ）逡逑Ａ逦Ｂ逡逑图１．２邋ＺＥＢ１在ＮＳＣＬＣ中的表达与生存时间的关系逡逑．３．２邋ＣＤ４４蛋白表达与ＮＳＣＬＣ患者无进展生存期（ＰＦＳ）及５年生存期的关逡逑ＣＤ４４蛋白表达阳性组的平均ＰＦＳ是１２．１５个月，，ＣＤ４４蛋白表达阴性组平逡逑ＰＦＳ是丨７．６５个月，二者差别有统计学意义。（Ｘ２邋＝邋８．１０１，邋／ＭＸ００４）（见图逡逑．３八）０0４４蛋内表达阳性组的平均５年生存期是５２．丨６个月，0４４蛋白表达逡逑性平均５年生存期是４３．２８个月，二者差别有统计学意义。（＃邋＝邋８．１０１，逡逑＝０．００４）（见图邋１．３Ｂ）。逡逑Ｆｉｖｅ邋Ｙ？0ｆｓ邋Ｏｅｒａｌ邋Ｓｕｖｔｖａｌ｜ＯＳ）逡逑Ｐｒｏ？ｒ？ｓｉｉｏｎ邋Ｆｒｅ？邋Ｓｕｒｖｉｖａｌ邋（ＰＦＳｔ逡逑
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

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