基于新型拉曼探针与先进性多巴胺芯片的胰腺癌外泌体快速微量检测的研制

发布时间：2020-04-07 01:54

【摘要】：第一部分PANC-1及HPDE6-C7细胞系外泌体的分离鉴定及特征性因子的检测本部分实验采用常规培养方法分别培养胰腺癌细胞系PANC-1和正常细胞系HPDE6-C7。外泌体分离采用超高速密度梯度离心法。分离得到的外泌体于透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)下进行粒径和大小的观察。外泌体计数采用纳米分子追踪分析(Nanosight Tracking Analysis,NTA)技术,经计算五次实验得到均值作为其最终浓度。外泌体表面分子的鉴定采用磁珠捕获结合流式分析法和流式纳米分析法,蛋白定量采用BCA法,ZETA电位经Zetasizer Nano仪器测得。经实验,透射电镜结果显示,PANC-1与HPDE6-C7细胞系来源的外泌体(以下简称EXO-PANC1,EXO-HPDE6-C7)直径在30-180nm之间;NTA分析得到EXO-PANC1溶液的浓度为2.72*10~(10)±2.05*10~9个/ml,EXO-HPDE6-C7溶液的浓度为2.43*10~(10)±2.21*10~9个/ml;BCA法测定EXO-PANC1溶液的蛋白浓度为111.31μg/ml,EXO-HPDE6-C7溶液为109.89μg/ml;Zeta电位分析得到EXO-HPDE6-C7的ZETA电位为-25.4mV,EXO-PANC1为-10.1 mV。磁珠结合流式分析结果显示,CD9,CD63不能显著地将EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7区别开,而磷脂酰肌醇聚糖-1(Glypican-1,GPC-1)和巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)可明显将两者区别开来,流式纳米分析结果显示EXO-PANC1表面高表达MIF与GPC1抗原。本部分结果证明PANC-1与HPDE6-C7得到的外泌体符合目前文献规定的相关特性(粒径大小,CD9,CD63分子的表达),在胰腺癌细胞系来源的外泌体中高标达的GPC1与MIF分子可作为后续实验检测的靶向分子。第二部分包被抗体的多巴胺芯片及SERS探针相关制备条件的摸索本部分实验中我们初步拟定了多巴胺芯片的制备步骤并探讨了多巴胺溶液浓度对芯片合成效果的影响。对用于表面增强拉曼散射(surface-enhanced raman scattering,SERS)技术检测的纳米探针的合成,我们首先采用经典途径合成18nm AuNPs作为核心,进而逐渐形成Au@Ag@pATP材料结构。为了保护较为脆弱的银层,我们在银表面添加了一层保护性牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)。为将检测抗体连接到纳米颗粒表面同时不影响其稳定性和生物相容性,我们利用多巴胺的聚合作用将抗体黏附到纳米颗粒表面,从而形成了多层包被的纳米球SERS探针结构。我们对SERS探针的TEM镜下成像、紫外光谱、SERS光谱等特性进行了鉴定,并对探针合成过程中关键性影响因子-AgNO3溶液浓度及pATP溶液浓度进行了摸索。经实验,我们得知在多巴胺溶液浓度为33mM时芯片合成聚合效果最佳。SERS探针合成过程中AgNO3溶液为0.096mM,pATP溶液为9.6mM时效果最佳。TEM电镜下观察到Ag层的厚度为1nm左右,多巴胺为3nm左右,紫外可见吸收光谱观察到金纳米颗粒仅有一个吸收峰(521nm),而SERS探针有两个吸收峰(400nm与500nm),分别来源于银与金纳米颗粒。拉曼光谱显示SERS探针有较强的拉曼信号峰(1072-1076cm~(-1))。在低功率(0.05mW)和短扫描时间(10ms)的条件下,拉曼信号依旧可以获得。经本部分实验摸索得到的上述多巴胺芯片-SERS体系的优化条件将用于进一步实验体系的建立。第三部分多巴胺芯片-SERS检测系统用于细胞系外泌体的检测及其体系优化本部分实验我们分别以不同抗原为靶点,利用前期建立的多巴胺芯片-SERS体系对EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7进行了检测。结果表明以GPC1或MIF为靶点的多巴胺芯片-SERS检测体系能够将EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7进行区分,以CD9,CD63为检测位点不能有效地将两者区分。我们进一步加入表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR),对分别以MIF,GPC1,EGFR,CD63这四种抗原为靶点的多巴胺芯片-SERS体系的检测效能进行了评价,发现MIF/GPC1/EGFR组具有相同的最低检测限(9.0*10~(-19)mol//L),而CD63组不能检测到该最低浓度下的外泌体。从各组得到的线性方程式来看,MIF组线性方程式的斜率最高,证明其检测灵敏度更高。接下来,我们以MIF为检测靶点对EXO-PANC1进行了检测,并对其进行了标准曲线绘制,低浓度外泌体溶液条件下的线性拟合方程公式为y=-2.4152+1.2392x。该体系可检测到2μl浓度为5.44*10~2个/ml外泌体溶液中的EXO-PANC1,相比较于商业化ELISA试剂盒灵敏度大大提高。本部分结果显示以MIF为靶点的多巴胺芯片-SERS检测体系其诊断效能远高于其他体系,可用于后续临床标本的测定。第四部分多巴胺芯片-SERS检测系统用于胰腺癌患者血清标本的检测及检测效能的评价本部分实验中我们首先以MIF/GPC1/EGFR为靶点利用多巴胺芯片-SERS体系对胰腺癌患者和健康人血清标本进行了检测,结果表明仅MIF-SERS体系能够将胰腺癌患者与正常人、胰腺癌患者P1~2与P3期、胰腺癌患者转移与未转移组进行区分(P0.05)。我们进一步将MIF-SERS体系检测结果与临床检测指标癌抗原(cancer antigen 19-9,CA19-9),癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)及MIF-ELISA商品化试剂盒检测结果进行了比较,发现CA199能够将胰腺癌患者与健康人区别开(P0.05),但不能将胰腺癌患者P1~2与P3期、转移与未转移组进行区分(P0.05),其与MIF-SERS体系有相似的灵敏度(68.2%vs 62.5%)与特异性(72.7%vs 76.2%)。对CEA的结果分析显示,该指标不能将上述三组进行区分(P0.05),其灵敏度较MIF-SERS体系降低了21.6%,特异性降低了12.6%。ELISA法的灵敏度与特异性相比较于MIF-SERS体系分别降低了21.6%,16.2%。此外,与上述经典方法比较,MIF-SERS体系的血清用量大大减少(1-2mL vs 2μL)。根据标本检测值我们初步制定以MIF为靶点的log(拉曼信号)的临床参考值范围为胰腺癌vs正常:3.77±0.15 vs 2.67±0.80,cutoff值为3.55,拉曼信号成像点的扫描信号强度阈值为20。接下来,我们用统计学方法对MIF,GPC1,EGFR三组的检测结果进行了联合分析,发现联合诊断的灵敏度较单独的MIF-SERS体系提高了12.5%,特异性与MIF-SERS体系相当(75.0%vs 76.2%),经计算其cutoff值(胰腺癌患者vs健康人)为0.27。通过本部分实验,我们基本上构建了以MIF为靶点的多巴胺芯片-SERS检测体系,该体系结合GPC1,EGFR等检测指标,有希望应用于临床检测与胰腺癌的辅助诊断。
【图文】：

文氮中永久保存。复苏细胞时将冻存细胞液于n 后去除冻存液，用培养液重悬后按上述培分离养至最佳生长状态，胎牛血清于 120000g，4成含 10%FBS 的培养基，以此培养基培养细取。外泌体分离方法如下：将培养基于低转，，收集上清并经 0.22μm 过滤器过滤，于 12沉淀以 PBS 洗两次，重悬得到外泌体溶液

- 18 -图 2. Exo-HPDE6-C7 与 Exo-PANC-1 的特性鉴定. (a) Exo-HPDE6-C7 和(b)Exo-PANC-1 的TEM 图; (c) BCA 法测定外泌体溶液蛋白含量的标准曲线及计算公式，A562 即在 562nm 激光下测得的吸光度值；(d) Exo-HPDE6-C7 和(e)Exo-PANC-1 的粒径分布图; (f) Exo-HPDE6-C7 和 Exo-PANC-1 的 ZETA 电位。(二) 磁珠结合流式用于外泌体表面分子的鉴定结果1.检测原理：如图 3 所示，SM3-P100 磁珠经活化后其表面有各种活性功能基团（例如羧基、氨基等），这些基团在一定条件下可结合具有生物活性的抗体蛋白例如 anti-MIF，进而识别并捕获待测样本中表达 MIF 的外泌体。由于该磁珠粒径在纳米级别，故其处于顺磁状态，在外磁场中能被磁铁牢牢吸附从而快速分离捕获的外泌
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9;R730.43

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本文编号：2617294