【摘要】：结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率高居男性癌症发病率的第三位,和女性癌症发病率的第二位。近年来,随着诊疗技术的进步和发展,早期结肠癌治疗水平显著提升。然而,对于晚期和转移患者仍然缺乏有效治疗手段。肿瘤转移是恶性肿瘤治疗面临的巨大挑战,据统计,90%以上的癌症死亡病人可检测到肿瘤转移。基因治疗得到飞速发展,有望为肿瘤转移治疗带来突破。深入阐明恶性肿瘤发生远端转移的机制,筛选肿瘤治疗的潜在靶点,是基因治疗的关键与基础。Spreds(Sprouty related with EVH1 domain)为一类与Sprouty相关的细胞膜蛋白,可负调控Ras-Raf-ERK信号通路。我们前期研究显示,Spreds成员Spred2可调控慢性粒细胞白血病(Chronic myelocytic leukemia,CML)和肝癌细胞的增殖和凋亡,抑制肿瘤的生长。然而,Spred2在结肠癌发生、发展和转移过程中的作用及机制尚不明确。转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TGFβ)是一种多功能细胞因子,在肿瘤发生和发展过程中起着双重作用:在肿瘤早期,TGFβ通过TGF-β/SMADs信号通路调控多个靶基因的表达,抑制增殖和促进凋亡;在肿瘤晚期,TGFβ信号的异常激活,可与多条信号通路,如血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)通路和缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor,HIF-1α)信号等发生cross-talk,进而促进肿瘤的生长和转移。更为重要的是,TGFβ能有效诱导肿瘤细胞上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT),促进肿瘤的侵袭和转移。研究表明,TGFβ的下游细胞内信号通路可受到RTK拮抗剂的负调控,而Spred2是RTK拮抗剂的一种。那么,Spred2能否通过TGFβ信号通路来影响肿瘤细胞的EMT和生物学性能呢?本课题旨在阐明Spred2对结肠癌细胞生物学性能的影响,并阐明其可能机制;同时,探讨Spred2与TGFβ信号通路在调控结肠癌细胞EMT中的作用,初步阐明Spred2调控EMT的可能机制,期望为结肠癌的治疗提供更加有效的治疗靶标。首先,收集了2009年-2012年期间在首都医科大学附属北京友谊医院手术的结肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织,共31对。我们通过采用实时定量逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法,检测了Spred1和Spred2 mRNA的表达。结果显示,结肠癌病人肿瘤组织中Spred2表达显著下调,而Spred1则无明显改变,表明Spred2可能在结肠癌发生、发展过程中发挥重要作用。其次,扩增纯化了表达Spred2的重组腺病毒Ad5/F11p.Spred2和对照病毒Ad5/F11p.Null。采用紫外分光光度法和极限稀释法,测定了病毒的纯度、颗粒滴度和感染滴度。结果显示,Ad5/f11p.Spred2和Ad5/f11p.Null的纯度分别为1.3521和1.4025,颗粒滴度分别为3.36×10~(11)VPs/mL和4.95×10~(11)VPs/mL,感染滴度分别为1.28×10~(10)IU/mL和2.5×10~(11)IU/mL,符合进一步功能实验的要求。Real-time PCR和Western-blotting结果显示,Ad5/F11p.Spred2可以高效介导Spred2在结肠癌细胞SW480和HCT116中表达。上述结果表明,我们已成功制备了高质量的病毒产品。再次,不同感染强度(25MOI、50MOI和100MOI)Ad5/F11p.Spred2和对照病毒Ad5/F11p.Null感染结肠癌细胞SW480后,于24h、48h,流式细胞术检测细胞凋亡;50MOIAd5/F11p.Spred2和Ad5/F11p.Null感染SW480后0h,24h,48h,72h和96h,流式细胞检测Dye670的荧光强度,分析细胞增殖活性;50MOI Ad5/F11p.Spred2和Ad5/F11p.Null感染SW480细胞后,采用划痕实验以及穿孔实验(Transwell),检测结肠癌细胞迁移能力的改变。结果显示,Ad5/F11p.Spred2能够促进SW480细胞的凋亡,并成一定的剂量和时效依赖关系;能够抑制SW480细胞的增殖和迁移。上述结果表明,Spred2高表达能够抑制结肠癌细胞的增殖和迁移,并促进凋亡。然后,明确了TGF-β对结肠癌细胞EMT的作用。采用10ng/ml的重组人TGF-β因子刺激结肠癌细胞SW480,通过形态学观察、Western-blotting、免疫荧光和激光共聚焦等方法检测明确TGF-β对EMT的影响。我们发现,TGF-β可促进SW480细胞的迁移,并引起细胞间质样转变;下调上皮标志分子E-cadherin的表达,上调间质标志分子N-cadherin和Vimentin的表达。与我们预期一致,TGF-β可促进下游分子Smad2/3和Smad4的表达。上述结果提示,TGF-β在诱导SW480细胞EMT过程中发挥重要作用,而TGF-β介导的EMT可能是促进SW480细胞迁移的重要机制。最后,在不同遗传背景的结肠癌细胞中,检测了Spred2对TGF-β/SMADs信号通路及结肠癌细胞EMT的作用。50MOI Ad5/F11p.Spred2感染SW480细胞、24h和48h,收集蛋白,Western-blotting检测上皮-间质转化相关标记分子、TGF-β/SMADs和MAPK/ERK信号通路相关分子,以及EMT相关转录分子的表达。结果显示,Ad5/F11p.Spred2可高效表达Spred2蛋白,有效抑制ERK磷酸化,但对Smad2/3和Smad4表达无明显影响;能够抑制EMT相关转录因子Snail和Slug的表达,促进E-cadherin的表达,并抑制Vimentin的表达,但对N-cadherin表达无明显影响;免疫荧光细胞检测结果进一步提示,Ad5/F11p.Spred2可抑制SW480的EMT。在HCT116细胞中,100MOI Ad5/F11p.Spred2感染不仅能够抑制HCT116细胞ERK磷酸化,还可下调Smad2/3和Smad4蛋白的表达;可以抑制EMT相关转录因子Snail和Slug的表达,抑制EMT标志蛋白Vimentin和N-cadherin的表达。上述结果表明,Ad5/f11p.Spred2可负性调控Ras-Raf-ERK信号通路和TGF-β/SMADs信号通路,进而抑制结肠癌细胞的EMT和迁移。综上所述,Spred2在结肠癌病人组织中表达下调,而Spred2高表达能够抑制结肠癌细胞的增殖和迁移、抑制结肠癌细胞的凋亡。进一步研究表明,Spred2高表达能够抑制Ras-Raf-ERK信号通路和TFG-β/SMADs信号通路,并抑制结肠癌细胞的EMT。因此,Spred2有望成为结肠癌治疗的候选靶标。
【图文】：
紫溶液的孔中，进行染色 20min。余燃料吸出，并用 PBS 清洗两遍小室，再用无菌棉签轻微擦，在光学显微镜下进行观察拍照，，观察 9 个视野，统计穿孔3 实验结果癌患者肿瘤组织中 Spred1 和 Spred2 表达检测2009 年-2012 年之间前往北京首都医科大学附属北京友谊医肿瘤组织和癌旁组织，采用 real-time PCR 检测了目的基因表达水平。结果显示，与癌旁组织相比，肿瘤组织中 Spred1 无统计学差异；而 Spred2 的表达显著下调（p<0.01）。因此肠癌发生发展过程的关键分子。
.Spred2 感染 SW480 细胞后，real-time 检测目的基因 Spred2 mR.Spred2，Ad5/F11p.Null 感染结肠癌 SW480 后，Spred2 蛋p.Spred2 和 Ad5/F11p.Null 感染结肠癌 SW480 后，于 24h 收过 Western-blot 检测蛋白水平 Spred2 的表达。结d2 可在结肠癌细胞 SW480 中表达目的蛋白 Spred2。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.35
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本文编号：2618358
