声动力治疗肝癌小鼠的免疫学机制研究

发布时间：2020-04-07 17:44

【摘要】：声动力疗法(SonodynamicTherapy,SDT)是一种新型的癌症治疗方法,他的基本原理与光动力治疗相似,利用声敏剂可特异性浓聚在肿瘤组织的特性,超声能使组织中的氧活化为单态氧,最终导致肿瘤细胞死亡。但是值得一提的是,跟光动力治疗(Photodynamic Therapy,PDT)激光对组织的穿透力不同,超声可以深入到组织中,这就为使用声动力治疗深部肿瘤组织提供了可能性。近来有研究报道PDT治疗肿瘤具有肿瘤疫苗的特性,而SDT的作用机制与PDT相似,因此我们假设,SDT也可以作为一种癌症疫苗有效地发挥作用。因此,我们制定了一种治疗策略,探讨SDT能否消除原发性肿瘤,抑制转移,防止肿瘤复发。目的:探讨声动力(SDT)治疗肝癌小鼠的免疫学机制。方法:使用正交设计对声敏剂浓度、超声强度、超声频度及照射时间四因素三水平进行分组,共分为9组。采用MTT实验法测定细胞生存率,流式细胞术测定肿瘤细胞的凋亡率及流式细胞术测定活性氧释放量来选择最佳参数组合。然后使用最佳参数组合,探讨声动力治疗的免疫效应。采用免疫荧光法和流式细胞术对体外培养的H22肿瘤细胞表面的钙网蛋白(Calreticulin,CRT)进行测定:建立H22小鼠肿瘤模型观察SDT对H22小鼠肿瘤大小和对远处(远隔)肿瘤的抑制作用。使用ELISA测定各组血清IL-2、IFN-γ和IL-10水平。用免疫组化检测CD4、CD8、CD68、CD163、FOXP3等标志在肿瘤组织中的表达情况。使用LDH释放实验来评估处理后小鼠脾细胞对H22和S180肿瘤细胞特异性杀伤能力及远处肿瘤的免疫组化实验证实声动力引发的免疫特异性。结果:MTT实验结果显示:声动力疗效最好的参数组合是A2、B2、C3和D3;流式细胞术测定细胞凋亡率结果显示:声动力疗效最好的参数组合是A3、B3、C1、D3;流式细胞术测定活性氧释放量结果示:HPD为20μg/ml时,声动力产生的活性氧浓度最高,杀伤肿瘤细胞的能力最强,其余因素个水平无显著特异性。综合上述实验结果显示:声动力最佳组合为超声强度为1.0 W/cm2,声敏剂浓度为20μg/ml,照射时间为30分钟。由于超声频率三水平之间无明显差异,因此对于超声频率在后续实验中我们选择使用50%。单次声动力照射治疗,疗效较弱,因此我们选择通过增加连续照射次数,即延续照射时间,来达到增强疗效的效果。结果显示在连续辐照4周期(即照射时间为2小时),肿瘤大小明显小于其他组(P = 0.001)。因此,声动力在本实验中的参数组合最后确定为:超声强度为1.0 W/cm2,声敏剂浓度为20μg/ml,超声频度为50%,照射时间为2h,并将应用于后续实验。探讨声动力治疗的免疫效应结果显示:流式细胞技术和免疫荧光染色测定结果显示:声动力组(SDT)处理的H22细胞表面检测到较单纯超声组、单纯声敏剂组及对照组有更显著的CRT表达。声动力组(SDT)对皮下肿瘤可观察到明显的抑制生长的作用,随时间延长肿瘤逐渐变小,并且对远处(远隔)肿瘤的抑制作用。同时,6周期声动力治疗效果较4周期明显,因此后续小鼠实验均选用6周期声动力治疗。6周期声动力治疗后,小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平明显高于其余三组的相应细胞因子水平(P0.0001);相反,IL-10水平明显低于其余三组水平(P0.0001)。在SDT的肿瘤组织中CD4、CD8、CD68的表达水平较高,CD163、FOXP3的表达水平较低。单因素方差分析显示:组间差异显著(CD4(P0.001);CD8(P0.001);CD68(P0.001);CD163(P = 0.005);和 FOXP3(P0.001))。LDH 释放实验显示结论:对于H22肿瘤细胞,D组的脾细胞杀伤能力明显高于其余三组(P0.0001),在效靶比为100:1(P0.0001)时,杀伤能力最强。而相反,对于S180,声动力组的脾细胞的杀伤能力与其他组没有明显差异。小鼠的远处肿瘤组织进行免疫组化结果显示,声动力组的小鼠中组织中出现明显的CD4,CD8T细胞的浸润。Image-pro+6.0对细胞的免疫阳性进行了定量分析显示:各组间差异显著(CD4 P0.001;CD8P0.001)。结论:SDT能产生有效的癌症疫苗的潜力,可以抑制原发性和远隔的肿瘤生长,值得做进一步深入研究。
【图文】：

细胞存活率,活性氧,浓度

甚至导致其坏死，被认为声动力杀伤肿瘤细胞的主要机制之一。因此，我们用逡逑ＤＣＦＨ－ＤＡ染色法对ＲＯＳ的产生进行分析，并使用流式细胞仪进行测定。与阴逡逑性对照组相比，实验组Ｒ０Ｓ水平升高（图２－３邋）。单因素方差分析结果显示组间逡逑差异显著（Ｐ＝0．00４）。单因素分析表明，Ｒ０Ｓ的产生主要是由ＷＤ浓度决定的逡逑（Ｐ＜０．００１）。对于ＨＰＤ浓度，Ａ３产生的活性氧浓度最高（ＲＯＳ＝７４．５０８），Ａ１水逡逑平分别于Ａ２和Ａ３水平均存在显著性差异，而Ａ２和Ａ３之间没有显著差异。逡逑因此，ＨＴＯ为２０（＾／１１１１时，声动力产生的活性氧浓度最高，，杀伤肿瘤细胞的能逡逑力最强。逡逑１６逡逑

声动力治疗肝癌小鼠的免疫学机制研究

图２－３邋ＲＯＳ水平使用ＤＣＦＨ－ＤＡ测量
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

【参考文献】