PD-1阻断联合SA-GM-CSF膜锚定膀胱肿瘤干细胞疫苗治疗转移性膀胱癌及机制研究

发布时间：2020-04-09 04:44

【摘要】：研究背景和目的:膀胱癌(BCa)术后容易复发、转移,可能与“肿瘤干细胞”(CSCs)未被有效地清除或杀灭有关。CSCs是肿瘤的恶性增殖、复发、转移、侵袭和耐药等方面的根源。理想的治疗方法应该有效地杀灭CSCs。本课题组综合运用化疗药物加压筛选联合有限稀释法和无血清培养基法分离并获得了 MB49膀胱肿瘤干细胞。利用我们特有的细胞膜表面的蛋白质锚定技术,制备了一种细胞膜锚定GM-CSF的肿瘤全细胞疫苗,包含了所有的肿瘤细胞抗原,而且还有能增强免疫作用的细胞因子。这种疫苗能诱导机体产生抗肿瘤的免疫反应,有效地抵抗同种肿瘤细胞。这种肿瘤疫苗能有效地增加效应性CD4+ T和CD8+T淋巴细胞,诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫。但是在前期的研究中也发现,无论经过何种细胞因子修饰的肿瘤干细胞疫苗治疗后,部分小鼠皮下肿瘤不能完全消退,或者经历开始的消退后,再次生长。根据目前肿瘤免疫学的研究进展,机体在激活正性的抗肿瘤免疫反应的同时,存在肿瘤的免疫逃逸。PD-1/PD-L1在调节T淋巴细胞介导的细胞免疫中发挥着非常重要的作用,已成为近几年免疫治疗的研究热点。我们在研究中发现,GM-CSF锚定肿瘤细胞疫苗组小鼠肿瘤细胞表面PD-L1表达量明显增高,而且肿瘤组织中CD8+T细胞表面的PD-1表达量明显增多。因此,经过GM-CSF锚定肿瘤细胞疫苗治疗过的小鼠体内存在因PD-1/PD-L1通路激活而导致的免疫逃逸。我们设想:利用膜修饰GM-CSF的肿瘤干细胞疫苗以充分激活抗原提呈细胞,并促进肿瘤抗原的提呈,促进效应T淋巴细胞的活化和增殖,从而能诱导机体产生靶向杀伤肿瘤细胞的特异性免疫反应;在此基础上,如果能通过阻断PD-1/PD-L1信号通路,降低T细胞凋亡的发生,抑制相关免疫逃逸,很可能可以最大程度地诱导产生高强度、持久、特异性的抗肿瘤免疫反应。研究内容和结果:1.膀胱肿瘤干细胞的分离与鉴定采用化疗药加压筛选联合有限稀释法和无血清培养法分离和培养MB49膀胱肿瘤干细胞(MCSCs)。检测结果显示,MCSCs中CD133+CD44+比例明显高于MB49细胞;MCSCs中CD133、OCT4、NANOG的mRNA含量均明显高于MB49细胞;MCSCs在体外和体内均显示出更强的增殖能力;MCSCs对临床上常用的化疗药表现出更强的耐受性。2.SA-GM-CSF膜修饰的膀胱肿瘤干细胞疫苗的制备及其生物学活性检测利用我们特有的蛋白质锚定技术制备肿瘤干细胞疫苗,检测显示SA-GM-CSF能高效地锚定在细胞膜表面(98.7%),并且保持良好的生物学活性。3.SA-GM-CSF膜修饰的膀胱肿瘤干细胞疫苗用于治疗膀胱癌的疗效及相关免疫逃逸机制的研究GM-CSF膜锚定的CSCs疫苗能有效地激活机体的杀伤CSCs的免疫反应。但是,无论选用何种细胞因子修饰的MCSCs疫苗,部分小鼠皮下肿瘤不能完全消退,或者经历开始的消退后,再次生长。SA-GM-CSF膜修饰的MCSCs疫苗治疗后的肿瘤微环境中PD-L1的表达上调,CD8+PD-1+ T细胞的数量也增多,证实肿瘤微环境中存在PD-1/PD-L1介导的免疫逃逸。4.PD-1阻断联合SA-GM-CSF膜修饰的膀胱肿瘤干细胞疫苗用于治疗转移性膀胱癌的治疗效果及相关机制的研究(1)治疗效果PD-1阻断联合GM-CSF膜锚定的CSCs疫苗能有效地抑制小鼠皮下肿瘤的生长,显著增强机体靶向杀伤CSCs的能力,诱导机体产生针对CSCs的特异性免疫反应。(2)联合治疗的相关免疫学机制研究GM-CSF修饰的CSCs疫苗治疗能有效地促进DC的成熟。PD-1阻断联合GM-CSF修饰的CSCs疫苗能显著增加效应性CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量,特别是增加了对CSCs有直接毒性的IFN-γ+CD8+T淋巴细胞,而并不增加免疫耐受性Treg细胞的数量和比例。肿瘤组织中浸润性CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量明显多于对照组。PD-1阻断联合CSCs疫苗能诱导分泌更高浓度的正性免疫活性细胞因子IL-12和IFN-y,而不增加负性免疫活性细胞因子IL-10的浓度。IFN-y在促进肿瘤干细胞上调PD-L1中起着重要作用。PD-1单抗可以明显增强GM-CSF肿瘤细胞疫苗诱导的CTL活性,增强其杀伤肿瘤干细胞的作用。结论:1.采用化疗药加压筛选联合有限稀释法和无血清培养法分离和培养MB49膀胱肿瘤干细胞具有肿瘤干细胞的特点。2.SA-GM-CSF能高效地锚定在CSCs表面,且能保持良好的生物学活性。3.SA-GM-CSF膜修饰的CSCs疫苗能有效地促进DCs的成熟,有助于肿瘤细胞抗原的识别,但是肿瘤微环境中存在PD-1/PD-L1介导的免疫逃逸。4.在肿瘤干细胞疫苗治疗的基础上联合应用PD-1单抗,能诱导体内产生大量的效应T淋巴细胞,产生大量激活免疫反应的细胞因子,增强机体杀伤肿瘤细胞的能力,有效地抑制膀胱转移癌的发生和发展。
【图文】：

化疗药物,细胞,紫杉醇,存活率

逡逑者之间的差异有统计学意义（Ｆ邋＝邋８４．２４８，邋Ｐ邋＝邋０．０００，图１－５，表１－５）。ＭＣＳＣｓ逡逑对丝裂霉素具有更强的耐受能力。逡逑紫杉醇（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）：肿瘤干细胞的状态随着紫杉醇药物浓度的增加而逐渐变逡逑差，死亡细胞也逐渐增多。结果证实：随着紫杉醇的浓度由１０ｎＭ提高至１０ｕＭ，逡逑ＭＢ４９细胞的存活率由（８３．８７±９．３３）％下降至（３２．３０±３．９３）％，ＭＣＳＣｓ细胞的存逡逑活率由（９２．９７±２．９２）％下降至（７８．１３士８．０４）％，紫杉醇对膀胱癌细胞和膀胱癌干细逡逑胞均有杀灭作用。紫杉醇的浓度为１０ｎＭ低浓度时，ＭＣＳＣｓ和ＭＢ４９邋ｃｅｌｌｓ细胞逡逑存活率无差异，当浓度为１００ｎＭ，邋ｌｕＭ，１０ｕＭ时，ＭＣＳＣｓ细胞的存活率明显逡逑高于ＭＢ４９细胞

锚定,流式,组间,效率

２８２７．８１２，尸组间＜邋０．０１；邋Ｆ浓度＝１８６．９４３，邋Ｐ浓度＜邋０．０１；邋Ｆ组间ｘ浓度＝９５．７１８，Ｐ组间ｘ浓度＜逡逑０．０１。分析结果提示：锚定在肿瘤干细胞表面的ＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ双功能融合蛋白仍逡逑有效地促进小鼠骨髓细胞的增殖（Ｐ＜０．０５），且呈剂量依赖关系（图２－２，表２－１）。逡逑３０逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14

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