长链非编码RNASNHG16在肝细胞癌术后早期复发的作用及其机制研究

发布时间：2020-04-11 22:03

【摘要】：背景原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,患者的预后较差,完全切除术后复发率仍然较高。有部分肝癌患者在肿瘤切除术后,3个月内肿瘤再次复发,这种复发病人预后差,我们称之为早期复发。这可能是因为我们对肝癌的发生,发展机制了解较少。然而,随着测序技术的突破性进展,非编码RNA在肝癌中的异常表达,已经证明是影响HCC的重要因素。长链非编码RNA(long non-coding,lnc RNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,基本不具有转录,编码蛋白质的功能,然而现在肝癌、肺癌、胃癌等多种肿瘤中发现lnc RNA异常表达,lnc RNA在肿瘤的生长,繁殖过程中可能起到重要的作用。目前lnc RNA在肝癌中的研究仍较少,且大部分lnc RNA调控机制,具体功能仍然不是很清楚,因此有寻找与肝癌相关异常表达的lnc RNA是极其重要的。本课题组应用RNA-Seq检测患者术后3个月内肿瘤复发的肝癌组织和大于3年没有复发的患者肝癌组织lnc RNA表达谱的差异,通过生物信息学筛选出与肝癌相关的lnc RNA,并进行功能和机制研究。目的本课题组通过RNA-Seq技术HCC术后早期复发病人肿瘤组织中筛选出有着显著差异表达的长链非编码RNA,探讨该长链非编码RNA在肝癌早期复发中的生物学功能及其调控机制。方法1、利用RNA-Seq技术检测3例3个月内肿瘤复发的肝癌组织和大于3年没有复发的患者肝癌组织lnc RNA表达谱的差异,从表达水平、lnc RNA长度、数据库完整lnc RNA序列、GO富集及KEGG pathway分析等方面筛选与肝癌相关的差异表达的lnc RNA,利用实时定量PCR(q RT-PCR)在肝癌细胞系和组织中验证部分差异表达的lnc RNA,最后确定SNHG16为后续研究对象。2、FISH实验定位SNHG16在细胞中的表达位置3、收集20例行肝癌切除术患者的早期复发的肝癌组织和对应的癌旁组织,采用q RT-PCR方法检测SNHG16的表达情况。4、收集102例行肝癌切除术患者的肝癌组织分析SNHG16表达情况与患者临床病理特征及患者预后的关系。5、SNHG16靶基因的预测、验证及功能研究:结合基因定位分析和生物信息预测,推测SNHG16可能与mi R-17-5p竞争性调节P62,并采用荧光素酶实验报告验证P62,mi R-17-5p与SNHG16之间的关系。6、SNHG16调控的分子机制研究:利用q RT-PCR、Western-blot、检测m TOR通路。结果1、与3年没复发的肿瘤组织相比,选取在3月内复发的肝癌组织中同时高或低水平表达且2倍以上变化的lnc RNA,认为其差异表达有意义。通过生物信息学分析显示这些差异表达的lnc RNA与细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期等相关基因有关,部分还可能参与m TOR、NF-KB等信号通路调节。2、通过测序和组织筛选,我们发现lnc RNA SNHG16,其在早期复发的肝癌组织中均高表达,经q RT-PCR验证,lnc RNA SNHG16在肝癌细胞和早期复发肝癌组织中同时上调表达。SNHG16过表达与BCLC分期与肿瘤数目显著相关,Kaplan-Meier分析示SNHG16高表达与患者低生存率和高的肿瘤复发率有关。4、FISH定位分析发现SNHG16主要位于细胞质中表达,少量在细胞核中表达。5、荧光素酶实验报告结果表明SNHG16通过ce RNA机制竞争性结合mi R-17b-5p,调控P62的表达。6、q RT-PCR/Western-blot示SNHG16表达上调后,P62,P-m TOR显著上调,SNHG16表达下调后P62,P-m TOR下调。结论1、通过RNA-Seq,我们发现lnc RNA SNHG16,其在肝癌细胞及早期复发肝癌组织中均高表达,SNHG16的表达与肝癌患者的病理特征相关,且可预测肝癌患者预后。2、SNHG16通过ce RNA竞争机制调控mi RNA-17b-5p调控靶基因P62的表达,并激活下游m TOR通路促进肝癌细胞增殖,侵袭。因此,肝癌中可能存在SNHG16-P62-m TOR的调控机制,通过影响细胞增殖与凋亡促进肝癌的发生发展,这将为日后深入研究肝癌分子机制及临床治疗提供新思路。
【图文】：

荧光素酶,生物信息学分析,生物学效应,过表达

Fig 8. The luciferase report assay in Huh-7 cells.图 8. Huh-7细胞中荧光素酶报告。2.8. P62影响mTOR通路发挥生物学效应2.8.1 生物信息学分析本研究前期通过生物信息学分析发现，SNHG16可能可以通过调节影响HCC中的mTOR通路，我们通过WB和PCR，，从蛋白和mRNA层Huh-7细胞中分析mTOR通路的激活情况。2.8.2 WB验证WB实验显示：过表达的SNHG16相对NC有着更高的P62, mTOR, P
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

【参考文献】