一种新型多肽拮抗VEGF对树突状细胞成熟负向调控及相关机制的实验研究

发布时间：2020-04-12 17:25

【摘要】：背景:肿瘤免疫治疗是当前肿瘤综合治疗中最具有前景的疗法之一,.树突状细胞(Dendritic cell,DC)作为体内功能最强的专职抗原递呈细胞(professional antigen-presenting cell,APC),能够激活初始T淋巴细胞(naive T cells),从而启动特异性细胞免疫,在机体产生针对肿瘤的免疫应答中发挥着关键作用。既往研究证实,肿瘤细胞分泌多种免疫抑制因子,这些细胞因子能够作用于体内DC,干扰DC的正常发育和生理功能,构成肿瘤细胞的免疫逃逸机制。其中,血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowthfactor,VEGF)能够明显抑制DC的分化成熟,且该抑制性作用通过DC表面的神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1,NRP-1)作为共受体介导,NRP-1是一个很有前景的肿瘤治疗靶点。基于VEGF/NRP-1相互作用的结构关系,我们推测,可能存在一种多肽类NRP-1拮抗剂,能够竞争性阻断VEGF与DC表面NRP-1的特异性结合,逆转VEGF对DC分化成熟的负向调控,进而恢复DC在体内外的免疫激活和调节等相关作用,增强机体对肿瘤的有效免疫应答。目的:验证新型多肽MY1340与DC表面NRP-1是否特异性结合;体外实验明确MY1340能否拮抗VEGF对于DC成熟的抑制作用及相关机制;应用荷瘤小鼠探究在体内MY1340对脾脏中DC的影响及其对肿瘤生长的作用。方法:以健康成人外周血作为细胞来源,采用密度梯度离心结合磁珠分选从中提取单个核细胞,培养过程中添加IL-4和GM-CSF诱导单核向DC进行分化,使用LPS刺激DC成熟。通过形态学观察以及流式细胞术检测表型来验证未成熟DC(immature DC,imDC)以及成熟 DC(matureDC,mDC)。采用Pull-down实验结合液相二级质谱(LC-MS/MS)鉴定,并进一步应用Western blot验证来综合分析MY1340与DC表面的具体结合位点;采用竞争性ELISA实验确定MY1340是否能够影响VEGF-NRP-1复合物的形成;利用流式细胞术检测分析MY1340对VEGF影响下DC表型和吞噬功能改变的作用;采用Luminex液相芯片检测分析MY1340对VEGF作用下DC所分泌细胞因子变化的影响;应用流式细胞术检测MY1340对DC成熟相关通路信号分子磷酸化水平的影响以探索其作用机制。关于MY1340在体内的效果,我们通过建立荷瘤小鼠模型,用流式细胞术检测应用MY1340后小鼠脾脏DC数量以及成熟程度的改变,记录肿瘤生长以及小鼠的体重,观察内脏器官的形态变化以明确其体内效果。结果:应用密度梯度离心结合磁珠分选能够从健康成人外周血中分离出高纯度的单个核细胞,经形态学观察以及流式细胞术检测能够确定单核成功定向分化为imDC并在加入LPS刺激48小时后成熟。通过Pull-down结合LC-MS/MS以及Western blot验证,我们证明了 MY1340与NRP-1的直接特异性结合;并通过竞争性ELISA实验证明MY1340能够抑制VEGF与NRP-1的结合;通过流式细胞术、吞噬实验和Luminex细胞因子检测,从DC的表型表达以及功能两方面均验证了 MY1340能够桔抗VEGF对DC成熟的抑制作用;最后通过胞内磷酸化的检测,提示其促DC成熟可能是通过逆转VEGF对ERK1/2和NF-κB磷酸化的抑制作用来实现的。荷瘤小鼠实验证实:MY1340在体内能够抑制肿瘤的增长,流式检测结果显示MY1340能够促进小鼠脾脏DC的成熟。结论:新型多肽MY1340通过与NRP-1的特异性结合而抑制VEGF-NRP-1复合物的形成,通过拮抗VEGF对ERK1/2和NF-κB磷酸化抑制作用,逆转VEGF对DC成熟的负向调控,并在荷瘤小鼠体内促进DC的成熟进而起到抑瘤作用,有希望为肿瘤的免疫治疗疗效的提升以及DC疫苗的优化提供新的思路。
【图文】：

配体相结合，如血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）、神经轴突导向分子（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ，Ｓｅｍａ）、逡逑转化生长因子ｐ邋（ＴＧＦ－ｐ）以及促吞噬素（Ｔｕｆｔｓｉｎ）等［１－３］。ＮＲＰ－１的胞内区域较短，逡逑仅含４４个氨基酿不含激酶序列因而不能通过自身直接传导信号［４，５］（图１ＸＮＲＰ－逡逑１在胚胎发育时期的多种组织中有表达如神经组织、肾脏、骨骼和背主动脉等，主要逡逑参与胚胎期动脉和神经系统的发育，在成体内主要表达于树突状细胞、Ｔ细胞、神经逡逑内分泌细胞等表面，参与体内多种生理过程包括细胞迁移、血管生成以及免疫应答等逡逑［６－９］。除了在正常组织细胞中表达外，，近年来研究发现多种肿瘤细胞表面有ＮＲＰ－１表逡逑达，如骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌及神经胶质瘤等，且ＮＲＰ－１在肿瘤中的高表达逡逑与肿瘤的侵袭性、临床分级以及肿瘤分期通常呈正相关［１］。逡逑ＣｅｎｄＲ逦ＪＭＤ逡逑Ｎ逦Ｃ邋ｊａＥＳＢＥａｓＢｉＳＥＡ邋（Ｎｒ。＇逡逑ＳＥＭＡ３邋ｖｅＧＦ逦ｓｅｇｍｅｎｔ逡逑图１神经纤毛蛋白结构示意图［５］。逡逑树突状细胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ邋ｃｅｌｌｓ，邋ＤＣｓ）最早是由Ｒａｌｐｈ邋Ｓｔｅｉｎｍａｎ在１９７３年发现的一逡逑类专职抗原递呈细胞，能够摄取、处理以及递呈抗原，进而激活Ｔ细胞启动免疫应逡逑答

１邋＿逡逑ｍ￡－逦■邋Ｓ！逡逑、单个核细逡逑「＾胞逡逑淋巴细胞逡逑－分离液逡逑煖~弤+ｓ逡逑■Ｉ靥红细胞及逡逑＿粒细胞逡逑图ｕ密度梯度离心法从人外周血浓缩白细胞分离获取单个核细胞。逡逑
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.51

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本文编号：2624987