HIF-1a诱导胰腺癌细胞去分化及转移作用及其靶向成像研究

发布时间：2020-04-13 01:04

【摘要】：胰腺癌(Pancreatic cancer)在肿瘤导致死亡中位居第四位,具有进展迅速、转移早、放化疗抵制等特点。目前,胰腺癌基础及临床相关研究虽然获得了一些进展,但五年生存率仍维持在5%左右。针对胰腺癌的有效诊疗手段仍然任重而道远。探索胰腺癌发生、发展的过程及其确切机制,仍然是当前胰腺癌基础及临床研究的重点、难点。研究表明:应激(缺氧、乏养、放化疗)诱导的肿瘤微环境在肿瘤发生、发展过程中起着关键作用。病理研究显示:作为一种乏血供肿瘤组织,胰腺癌组织中存在大面积的低氧乏氧区。近年来,低氧诱导因子-1(Hyopxia induced factor-1)在实体瘤发生、发展过程中的作用引起了越来越多的关注。针对胰腺癌的大规模临床标本检测发现:HIF-1a表达水平与胰腺癌预后呈高度负相关,是诱导肿瘤增殖、血管生成、转移、免疫逃逸的关键分子。然而,其确切机制尚未完全阐明。本研究目的:(1)明确低氧条件下,HIF-1a诱导自噬在胰腺癌非干细胞去分化中的作用及其确切机制;(2)明确低氧条件下,HIF-1a诱导自噬在胰腺癌干细胞转移中的作用及其确切机制;(3)筛选能与HIF-1a特异性配对结合的DNA寡核苷酸短链,合成多功能纳米粒子,初步探讨其应用于胰腺癌干细胞体内外磁共振靶向成像效果。研究内容和方法:(1)采用改良的Transwell分离实验方法,筛选人胰腺癌细胞系(Panc-1)中胰腺癌干细胞以及胰腺癌非干细胞;并利用流式细胞仪、成球实验、免疫荧光、Western Blot及体内致瘤实验检测分选出的胰腺癌细胞的干性;(2)将分选出的胰腺癌非干细胞培养在间歇性低氧条件下(1%氧气、94%氮气环境中培养12 h后,再在20%氧气培养12 h,如此反复4次),利用干扰和沉默技术,给予以下分组:(1)对照组;(2)胰腺癌非干细胞+HIF-1a si RNA;(3)胰腺癌非干细胞+3-MA(自噬抑制剂);(4)胰腺癌非干细胞+HIF-1a si RNA+3-MA。在以下时间点(24h,48h,72h),采用显微镜观测细胞成球能力及形态,流式细胞技术检测细胞内CD133+细胞比例,RT-PCR及Western-blot分析细胞相关基因及蛋白表达水平变化(Oct-4、c-MYC、CD44、HIF-1a、LC3-I、LC3-II、Beclin 1)。(3)将分选的胰腺癌干细胞培养在间歇性低氧条件下(1%氧气、94%氮气环境中培养12 h后,再在20%氧气培养12 h,如此反复4次),利用干扰和沉默技术,给予以下分组:(1)对照组;(2)胰腺癌干细胞+HIF-1a si RNA;(3)胰腺癌干细胞+3-MA(自噬抑制剂);(4)胰腺癌干细胞+HIF-1a si RNA+3-MA。作用不同时间(24h,48h,72h)点,观察以下指标:Tranwell观察细胞转移情况;Western-blot检测细胞内相关蛋白的表达含量变化(HIF-1a、CD133、CD44、E-Ca、Vementin、MMP-9、LC3-II、Beclin 1)。(4)γ-Fe3O4@DMSA-DNA寡核苷酸短链纳米颗粒合成和制备;分析其稳定性及毒性。(5)胰腺癌干细胞、胰腺癌非干细胞与γ-Fe3O4@DMSA-DNA寡核苷酸短链纳米颗粒共浴,MTT及流式技术检测纳米粒子对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响;普鲁士蓝染色及3.0T磁共振观察纳米粒子与胰腺癌干细胞、胰腺癌非干细胞结合的特异性及体外成像靶向性。(6)构建胰腺癌裸鼠皮下瘤模型,尾静脉注射γ-Fe3O4@DMSA及γ-Fe3O4@DMSA-DNA纳米颗粒,注射后30min、1.5h、2h、24h等不同时间点,采用3.0T磁共振观察瘤体信号改变,测量T2弛豫时间。研究结果:(1)改良的Transwell分离实验可以作为分选肿瘤干细胞实验手段之一,且该方法具有简单易行、经济、可重复性强等特点。(2)间歇性缺氧条件下,HIF-1a可以通过诱导自噬,促进胰腺癌非干细胞去分化而获得干细胞的表型和功能。(3)作为缺氧诱导的核心分子之一,HIF-1a在缺氧应激条件下是促进胰腺癌干细胞转移的关键调控分子,而其主要通过诱导胰腺癌干细胞EMT转化及自噬来实现这一过程。(4)与HIF配对的DNA寡核苷酸短链偶联氧化铁纳米磁粒子可以特异性结合到胰腺癌干细胞,并且随着时间的延长,结合效率逐渐增高。胰腺癌非干细胞可以结合少量的DNA寡核苷酸短链偶联氧化铁纳米磁粒子,但即使共育时间延长,结合效率也无明显增高。同时胰腺癌干细胞结合纳米磁粒子的时间明显要早于胰腺癌非干细胞,这一时间梯度差,为临床MRI检测胰腺癌干细胞增加了可行性。(5)裸鼠皮下胰腺癌模型中,能特异结合HIF-1a的DNA寡核苷酸短链偶联氧化铁纳米磁粒子能在瘤体内聚集,其与单纯氧化铁纳米粒子在注射30min、1.5h、2h及24h后瘤体的T2弛豫时间有统计学差异。结论:(1)在缺氧应激条件下,HIF-1a通过自噬维持胰腺癌干细胞和胰腺癌非干细胞之间的动态平衡;并可以诱导胰腺癌干细胞通过EMT转化而转移。(2)氧化铁纳米粒偶联能特异结合HIF-1a的DNA寡核苷酸短链(γ-Fe3O4@DMSA-DNA寡核苷酸短链)较单纯氧化铁纳米粒在体外能相对特异性的结合HIF高表达的胰腺癌干细胞;能特异性聚集在胰腺癌肿瘤组织内,并且能有效的改变相应MR成像信号强度及T2豫驰时间。
【图文】：

细胞呈长梭形，随着培养时间延长，仍未见克隆球生长 (图2.1C-D) 。图 2.1 下室及上室细胞生长模式显微镜检测结果Figure2.1 The sphere formation from the lower chamber cells and the upper chamber cells.A，下室培养基中成圆形的球形生长，随着培养时间延长，克隆球体积增大。B，上室细胞呈平铺贴壁生长。2.2.2 流式细胞检测结果将改良Transwell分离的上室及下室细胞，流式细胞检测发现，与上室细胞及总细胞系中细胞相比，下室细胞内CD133+及CD44+细胞的百分数均明显升高。（图2.2）

图 2.2 下室及上室细胞中 CD133+及 CD44+细胞流式检测结果。Figure 2.2 The percentage of CD133+and CD44+subpopulations in theupper chamber cells.A：下室培养基中 CD133+比例增高；B：下室培养基中 CD44+比例增高T-PCR及Western Blot检测结果-PCR 及 Western-Blot 定量检测结果显示上室细胞、下室细胞及Oct-4 及 ESA 基因及蛋白水平，，结果提示：与上室细胞及总细中 CD24、Oct-4 及 ESA 在基因及蛋白水平存在明显差异 P＜0
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.9

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本文编号：2625398