Hedgehog信号通路抑制剂的鉴定与功能研究

发布时间：2020-04-14 05:03

【摘要】：【研究背景】Hedgehog信号通路是调节昆虫和胚胎发育的经典信号通路之一。Hedgehog信号通路在多个肿瘤中呈现出来了高度活化状态,包括结直肠癌,胰腺癌,髓母细胞瘤等等。多种证据表明Hedgehog信号通路的活化与肿瘤生长发育相关,因此也已经有相对应的靶向化合物出现,并且对肿瘤有一定的治疗效果。在肿瘤治疗中,诱导肿瘤细胞发生凋亡是重要治疗手段之一,凋亡的肿瘤细胞会被机体清除从而治愈肿瘤。因此,鉴定研究具有促凋亡活性的新型Hedgehog信号通路抑制剂对对于肿瘤治疗具有重要意义。【研究目的】选择和运用合适的小分子化合物筛选方案去筛选具有促凋亡活性的新型Hedgehog信号通路抑制剂。从分子生物学和细胞生物学等多个层面设计研究方案对发现的小分子化合物鉴定研究,阐明其作用机理和抗肿瘤作用,为肿瘤治疗提供新的方向。【研究方法】为了鉴定出可以诱导细胞凋亡的Hedgehog通路抑制剂,我们对于细胞进行凋亡抑制剂z-VAD预处理,然后利用合作的化合物合成课题组合成的300多个新型Hedgehog小分子抑制剂文库进行筛选,通过最终细胞ATP水平分析细胞存活率,结果鉴定出来一个促凋亡的小分子化合物Hh003。为了进一步确定Hh003诱导的细胞死亡是不是凋亡,我们对于Hh003处理的细胞进行了台盼蓝染色;同时也通过了运用流式细胞技术去检测Hh003处理之后的细胞的Annexin V/PI的阳性率。另一方面,为了鉴定小分子化合物Hh003对于Hedgehog信号通路的抑制作用,我们选用了一个上市药Vismodegib作为对照,同时构建了NIH3T3-GRE-Luc这个报告系统,发现小分子化合物Hh003对于Hedgehog的抑制作用明显好于Vismodegib,同时也对Hedgehog信号通路的关键基因GLI1和PTCH1有抑制作用。为了进一步阐明小分子化合物Hh003诱导细胞凋亡的分子机制,我们通过免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白Caspase8和Caspase9的切割,以及Caspase蛋白底物PARP的切割,并且运用si RNA沉默技术去鉴定具体凋亡途径,同时通过ELISA检测了小分子化合物Hh003对于肿瘤细胞自分泌TNF-ɑ的影响。此外,我们还检测了小分子化合物Hh003对于细胞克隆形成的影响。最后为了鉴定小分子化合物Hh003的抗肿瘤作用,我们构建了人结肠癌细胞HCT116的裸鼠移植瘤模型,进一步探究其体内抗肿瘤作用。【研究结果】(1)通过Hedgehog抗肿瘤文库筛选我们鉴定出来了可以诱导细胞死亡的小分子化合物Hh003;(2)小分子化合物Hh003诱导的细胞死亡可以被凋亡抑制剂z-VAD抑制;(3)小分子化合物Hh003处理的肿瘤细胞呈现台盼蓝染色阳性;(4)小分子化合物Hh003处理的肿瘤细胞在流式检测中呈现Annexin V/PI阳性升高;(5)小分子化合物Hh003对于Hedgehog信号通路具有抑制作用;(6)小分子化合物Hh003可以抑制Hedgehog信号通路关键基因GLI1和PTCH1的转录水平;(7)小分子化合物Hh003处理肿瘤细胞后引起PARP和Caspase8活化;(8)小分子化合物Hh003诱导的细胞凋亡会被Caspase8沉默所阻止,而Caspase9的沉默不行;(9)小分子化合物Hh003不影响肿瘤细胞TNF-ɑ的自分泌;(10)小分子化合物Hh003会明显抑制肿瘤细胞的克隆形成;(11)小分子化合物Hh003能够在裸鼠体内一定程度上抑制人结肠癌细胞瘤HCT116的生长。【结论】我们研究结果表明,我们发现了具有促凋亡活性的小分子化合物Hh003,它通过激活了Caspase8依赖的细胞凋亡外源性途径诱导肿瘤细胞凋亡,同时也抑制了Hedgehog信号通路。并且体内实验表明,小分子化合物Hh003对于人结肠癌细胞HCT116诱导的肿瘤生长也有一定的抑制作用。这些结果对于新型Hedgehog抑制剂的研发具有指导意义,也为治愈肿瘤提供新的方向。
【图文】：

gehog 信号通路抑制剂的鉴定与功能研究 结结 果1．在Hedgehog抑制剂文库中筛选到可以诱导细胞死亡的小分子化合物H靶向 HH 信号通路的化合物可以用来治疗基底细胞癌，目前研发出来的靶向 HH的主要有 2 个上市药，分别是 Vismodegib 和 Sonidegib。但是两个化合物各有其方，Vismodegib 的可溶性比较差，并且出现耐药性，而 Sonidegib 则是存在着一些包括轻微的会肌肉痉挛、以及失去味觉和脱发，严重的甚至会引起肌肉组织分解此，我们必须去研发新型的靶向 HH 信号通路的抑制剂。我们和其他的化合物研发课题组合作，合成了 300 多个靶向 HH 信号通分子化合物，在这其中去筛选能够在细胞中诱导凋亡的小分子化合物，并其对细胞的毒性作用。

果 Hedgehog 信号通路抑制剂的鉴定与功能研究2．小分子化合物 Hh003 在多个肿瘤细胞中诱导细胞死亡我们通过筛选发现了可以诱导肿瘤细胞死亡的小分子化合物 Hh003，为了进步确认 Hh003 诱导的肿瘤细胞死亡是不是普遍存在的现象，以及其对正常细胞无生理毒性，，我们在多个肿瘤细胞系和一株正常细胞系中用不同浓度的 Hh003理，观察其对细胞存活率的影响。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.2

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 范久亿;李军;丁士刚;;Wnt信号通路在结直肠侧向发育型肿瘤中的研究进展[J];胃肠病学;2018年11期

2 王雪;张评浒;;Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与自噬调控作用的研究进展[J];中国药科大学学报;2017年01期

3 许莹萍;王菲菲;李大金;王凌;;雌激素-雌激素受体信号通路对趋化因子的调控作用研究进展[J];生殖医学杂志;2017年09期

4 苏依拉其木格;;Hedgehog信号通路在肺癌中的研究进展[J];健康之路;2016年09期

5 滕振平;邢飞跃;;细胞外信号调节激酶1/2信号通路对B淋巴细胞的影响[J];中国药物与临床;2007年01期

6 杜婵;姜保国;;许旺细胞增殖和分化过程中的信号通路[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年03期

7 史琳琳;赵锋;高学军;李庆章;;乳蛋白合成信号通路的研究进展[J];中国畜牧兽医;2013年01期

8 柳海平;周明旺;李盛华;叶丙霖;吉星;柴喜平;陈威;吴献毅;;骨关节炎软骨细胞增殖相关信号通路研究进展[J];中国矫形外科杂志;2018年23期

9 牙甫礼;施译琳;李卿;马百会;王岩;陈彦球;杨燕;;辅酶Q_(10)通过调控糖蛋白Ⅵ信号通路抑制血小板聚集和活化[J];中国热带医学;2018年12期

10 舒扬;向敏;;Wnt信号通路在中枢神经系统中的作用及相关机制[J];江苏医药;2018年08期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 彭丽;章杰;刘伟;;病理性瘢痕相关信号通路的研究进展[A];2015江西省首届医学美容整形联合学术会议、江西省医学会第十一次医学美学与美容学术研讨会、江西省第四次中西医结合医学美容学术会议论文汇编[C];2015年

2 曾令启;叶章群;陈志强;杨为民;高文喜;;草酸激活人肾小管上皮细胞p38 MAPK信号通路的研究[A];中国中西医结合学会泌尿外科专业委员会第十四次全国学术会议暨2016年广东省中西医结合学会泌尿外科专业委员会学术年会论文集[C];2016年

3 王俊成;;炎症因子对成骨细胞分化过程中BMP信号通路的的影响[A];中华口腔医学会口腔修复学专业委员会第十次全国口腔修复学术大会论文集[C];2016年

4 苟黎明;李春洁;李龙江;;经典Wnt信号通路在下颌下腺分支形态发生过程中的作用与机制的初步研究[A];2017全国口腔颌面——头颈肿瘤外科学术研讨会论文集[C];2017年

5 谢玲;项晓琼;胡迎春;范宝星;霍艳英;李邦印;段瑞峰;张开泰;吴德昌;;细胞定位与信号通路检测技术在hrnt-1基因功能研究中的应用[A];中华医学会放射医学与防护学分会第三次全国中青年学术交流会论文汇编[C];2001年

6 林泓域;Yimon Aye;;Wnt信号通路与Nrf2信号通路之间的微妙关系——靶向化学平台T-REX在氧化还原信号通路研究方面的应用[A];第十届全国化学生物学学术会议论文摘要集（墙报）[C];2017年

7 张丽琳;常娜;蒋伶活;;镉胁迫下MAPKs信号通路的应答机制初探[A];第九届中国模式真菌研讨会摘要集[C];2016年

8 孙宏亮;许美花;王瑶;鲁文赓;;Wnt信号通路在牛胎盘发育过程中的功能[A];中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第十三次学术研讨会论文集[C];2016年

9 陈娉婷;周小青;刘旺华;曹泽标;陈昱文;;中药对神经干细胞增殖分化相关信号通路调控研究进展[A];第九次全国中西医结合诊断学术研讨会论文集[C];2015年

10 蒋丽;;转录因子Bach1抑制Wnt信号通路和血管新生[A];中国生理学会张锡钧基金第十三届全国青年优秀生理学学术论文综合摘要、中国生理学会第十一届全国青年生理学工作者学术会议论文摘要[C];2015年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 本报记者 白毅;mTOR信号通路为肿瘤治疗提供新靶点[N];中国医药报;2010年

2 记者 王丹;最强激光“照亮”药靶重要信号通路[N];健康报;2015年

3 ;完美实现信号通路间的自由切换[N];通信产业报;2008年

4 本报特约撰稿 樊平;肿瘤信号通路靶点研发线吸睛[N];医药经济报;2018年

5 衣晓峰　陈英云 记者 李丽云;结肠癌发生中新的信号通路找到[N];科技日报;2009年

6 刘海英;美发现两种细胞信号通路互动机制[N];科技日报;2009年

7 衣晓峰;哈医大发现结肠癌发生中新的信号通路[N];中国医药报;2009年

8 记者 刘海英;英发现细胞信号通路新“刹车”蛋白[N];科技日报;2012年

9 中山大学肿瘤医院血液肿瘤科 吕跃 王华;难治性HL研究砥砺前行[N];医药经济报;2013年

10 刘禹 记者 王春;个体衰老速度差异谜团揭开[N];科技日报;2017年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 吴慧;活性多肽的表达及功能研究[D];国防科学技术大学;2017年

2 张辉;Erythropoietin信号通路对成体大鼠脊髓内源性神经干细胞增殖分化作用的实验研究[D];安徽医科大学;2018年

3 孙海涛;NF-κB P65通过Wnt信号通路调控HSCs活化的分子机制及鳖甲寡肽I-C-F-6的干预作用[D];南方医科大学;2018年

4 肖华;吡非尼酮抑制Hedgehog信号通路延缓肺纤维化[D];南方医科大学;2018年

5 王远;OSR1在调控Wnt信号通路和肺癌增殖、侵袭中的作用和机制研究[D];中国医科大学;2018年

6 郑新春;IL-21R信号通路在肝癌发生发展中的作用及其机制研究[D];南方医科大学;2018年

7 韩晶晶;Nrf2信号通路在急性移植物抗宿主病中的作用及机制研究[D];苏州大学;2018年

8 王凡;HIF-1信号通路在多囊卵巢综合征中的作用及其调控机制[D];福建师范大学;2017年

9 鲁茜;TGF-β1/PI3K/Akt信号通路在糖尿病肾病中的作用[D];南京医科大学;2013年

10 董雄伟;氨基硫脲类螯合剂由抑制SOD1调控活性氧ERK信号通路[D];华中师范大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 王晶;PDGF-BB介导的PI3K信号通路在BMSCs促进AD细胞模型损伤修复中的机制研究[D];昆明医科大学;2018年

2 郑学忠;基于miRWalk2.0对miR-145通过IRE1α-XBP1信号通路调控平滑肌细胞增殖的研究[D];昆明医科大学;2018年

3 王媛;p53和NF-κB信号通路在MTB感染AECⅡ细胞中的免疫调控作用[D];宁夏大学;2018年

4 王洁;CTRP3通过AKT信号通路调节HepG2细胞LDLR表达及机制研究[D];山西医科大学;2018年

5 陈嘉成;RhoA/ROCK1信号通路在BMSCs肝向分化过程中的变化特征[D];南华大学;2018年

6 刘旭丹;RES通过TLR4与PI3K/Akt信号通路发挥抗IL-1β诱导的骨关节炎作用的体外实验研究[D];中国医科大学;2018年

7 张琰;Wnt与NF-κB信号通路在调控LPS刺激的BV2细胞炎症的机制研究[D];昆明医科大学;2018年

8 高丹;B细胞受体信号通路抑制剂在慢性淋巴细胞白血病中疗效及安全性的meta分析[D];山西医科大学;2018年

9 刘怀泽;SENP1通过调控Glil的去SUMO化过程抑制Hedgehog信号通路[D];南京医科大学;2016年

10 沈龙艳;Hedgehog信号调节Sufu蛋白细胞定位的机制研究[D];南京医科大学;2016年

本文编号：2626913