膜相关胶原ⅩⅢ通过增强癌细胞侵袭和干细胞样特性促进乳腺癌转移

发布时间：2020-04-14 16:12

【摘要】：背景:胶原表达的增加和沉积与乳腺癌发展及癌症病人的不良预后相关。乳腺密度是乳腺癌发病的一个危险因素,乳腺密度增加部分由于胶原蛋白沉积增加。在结肠癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌和卵巢癌等上皮来源的肿瘤中均可检测到胶原XIII m RNA表达增加。然而胶原XIII在乳腺癌中的功能和调控机制尚不明确。尽管胶原XIII在细胞与细胞之间、细胞与基质之间发挥作用,但它是否在乳腺癌的发生发展中起作用仍有待研究。目的:本研究通过在TNBC细胞和正常乳腺上皮细胞中敲除及过表达胶原XIII,探讨其对乳腺癌细胞恶性表型和干细胞样特性的作用;通过使用活化的β1整合素功能阻断性抗体,探讨胶原XIII通过β1整合素激活TGF-β通路;通过小鼠异种移植实验及肺转移实验,探讨胶原XIII在肿瘤原位生长及转移中的作用。从而最终明确胶原XIII促进乳腺癌转移的分子机制。方法:(1)使用蛋白免疫印迹(westernblot)法检测胶原XIII在多种正常乳腺上皮细胞及不同类型乳腺癌细胞中的表达量。通过生物信息学分析,统计正常乳腺组织与乳腺癌组织,恶性程度不同的乳腺癌组织及总体生存期不同的乳腺癌患者体内胶原XIII表达量的差异。明确胶原XIII与乳腺癌发展之间的关系。(2)使用Crispr/cas9基因敲除技术建立MDA-MB-231-Col13-/-细胞系,并筛选得到两个单克隆MDA-MB-231-Col13-/-(25)和MDA-MB-231-Col13-/-(28)。通过基因组测序技术和westernblot确认COL13A1基因敲除成功。使用含有胶原XIII过表达的慢病毒感染MCF-10A细胞,得到MCF-10A-Col13细胞系。通过westernblot和免疫荧光染色确认胶原XIII成功表达。使用Crispr/cas9和慢病毒技术构建T4-2-Ctrl,T4-2-Col13-/-和T4-2-Col13细胞系,通过western确认胶原XIII敲除及过表达。(3)通过MDA-MB-231-Col13-/-(25/28)和MCF-10A-Col13细胞的体外3D细胞培养技术、Transwell侵袭实验和单个细胞迁移实验,研究胶原XIII诱导的侵袭性表型形成;通过免疫荧光染色,统计不同时间点Ed U和caspase3阳性的细胞数,研究胶原XIII对细胞增殖和凋亡的影响。通过Transwell侵袭实验检测T4-2-Ctrl,T4-2-Col13-/-和T4-2-Col13细胞的侵袭性改变。(4)通过在悬浮条件下乳腺肿瘤微球形成实验研究胶原XIII对癌细胞集落形成能力的影响。利用流式细胞术检测悬浮培养条件下细胞表面磷脂酰丝氨酸的表达量变化,利用westernblot检测PARP-cleaved的表达量。通过乳腺肿瘤微球形成实验,检测T4-2-Ctrl,T4-2-Col13-/-和T4-2-Col13细胞的集落形成能力改变。明确胶原XIII在增强癌细胞的干细胞样特性中发挥的作用。(5)通过免疫荧光染色,研究胶原XIII对整合素β1的活化作用。通过使用活化的整合素β1功能阻断性抗体,明确胶原XIII诱导的癌细胞浸润侵袭和迁移能力、乳腺微球形成和失巢凋亡抵抗能力至少是部分通过整合素β1实现的。(6)通过westernblot实验观察不同时间点p-Smad2/3和Smad2/3比值的变化,结合TGF-β诱导的双荧光素酶报告基因实验,研究胶原XIII对TGF-β1信号通路的活化作用。加入活化的整合素β1功能阻断性抗体后,对该通路活化作用的影响。明确胶原XIII可通过整合素β1激活TGF-β信号通路。(7)构建表达生物荧光素酶的MDA-MB-231-luc-D3H2LN-Ctrl/Col13-/-细胞系和绿色荧光蛋白标记的MDA-MB-231-GFP-Ctrl/Col13-/-细胞系。通过尾静脉及乳腺脂肪垫注射入SCID小鼠体内,建立TNBC细胞的异种移植和肺转移模型。通过心脏注射建立TNBC细胞的骨转移模型。通过生物发光体内成像系统(invivo imaging system,IVIS),荧光照相机和HE(hematoxylin-eosin)染色检测肿瘤原位生长、肺部定植和骨转移的能力,明确高表达的胶原XIII在促进乳腺癌细胞原位生长和转移过程中的作用。结果:(1)乳腺癌的发展伴随着胶原XIII的诱导表达:Westernblot结果显示,TNBC细胞系比管腔样乳腺癌细胞系或非恶性乳腺上皮细胞系的胶原XIII表达量更高。芯片数据库分析结果显示,人乳腺癌组织中胶原XIII m RNA水平显著高于正常乳腺组织(p0.01);ER阴性的乳腺癌组织中胶原XIII m RNA的表达量高于ER阳性的乳腺癌组织(p0.01);TNBC组织中胶原XIII m RNA的表达量高于其它亚类的乳腺癌组织(p0.01);Kaplan-Meier logrank分析结果显示,胶原XIII高表达的乳腺癌患者总体生存期低于胶原XIII低表达的乳腺癌患者(p0.001)。ER阴性的乳腺癌患者中,胶原XIII表达量高者的总体生存期更短(p0.001)。(2)胶原XIII促进TNBC细胞侵袭性恶性表型形成:与对照组相比,MDAMB-231-Col13-/-(25/28)中侵袭性分支显著降低(克隆25:p0.001;克隆28:p0.001)。胶原XIII过表达增加MCF-10A细胞的3D克隆体积(day4,p0.05;day5~day11,p0.001)。MCF-10A-Col13组的Ed U阳性率显著高于对照组(day6,p0.001;day8,p0.001;day10,p0.001)。胶原XIII过表达的MCF-10A细胞中可检测到活化的caspase3有减少的趋势(p=0.098)。胶原XIII敲除显著降低MDA-MB-231细胞的浸润侵袭能力(克隆25:p0.01;克隆28:p0.01)。相反,过表达胶原XIII的MCF-10A细胞浸润侵袭能力高于对照组(p0.05)。胶原XIII敲除的MDA-MB-231细胞单个细胞迁移速度和距离均降低(速度:克隆25,p0.05;克隆28,p0.05;距离:克隆25,p0.05;克隆28,p0.05)。而胶原XIII过表达可显著提高MCF-10A细胞的迁移速度和距离(速度,p0.001;距离,p0.001)。胶原XIII敲除可降低T4-2细胞的浸润侵袭能力(p0.05),而过表达胶原XIII不能显著提高其浸润侵袭的能力。(3)胶原XIII的表达增强癌细胞的干细胞样特性:胶原XIII敲除的MDAMB-231细胞肿瘤微球形成率低于对照组(克隆25,p0.001;克隆28,p0.001)。相反,过表达胶原XIII的MCF-10A细胞乳腺微球形成率高于对照组(p0.001)。在MCF-10A细胞中胶原XIII的表达降低了悬浮培养条件下诱导的细胞表面磷脂酰丝氨酸(p0.01)和PARP-cleaved的表达量。而在MDA-MB-231细胞中,胶原XIII沉默表达增加了细胞表面磷脂酰丝氨酸的量(p0.001)。胶原XIII敲除可降低T4-2细胞的肿瘤微球形成率(p0.05),而过表达胶原XIII不能显著提高该能力。(4)胶原XIII通过整合素β1促进肿瘤微球的形成和激活TGF-β信号通路:胶原XIII敲除的MDA-MB-231细胞中活化的整合素β1位点减少(克隆25,p0.01;克隆28,p0.001)。相反,过表达胶原XIII的MCF-10A细胞会诱导整合素β1的活化(p0.01)。整合素β1功能阻断性抗体可降低MCF-10A细胞中胶原XIII诱导的单个细胞迁移(速度,p0.001;距离,p0.001)、侵袭(p0.01)和乳腺微球形成(p0.05)能力。在过表达胶原XIII的MCF-10A细胞中抑制整合素β1的活性可增加PARP-cleaved的表达量。与对照组相比,在胶原XIII敲除的MDA-MB-231细胞中,TGF-β诱导的Smad2/3磷酸化水平降低(MDA-MB-231-Col13-/-(25):0.5h,p0.05;1.0h,p0.05;2.0h,p0.05;24h,p0.05;MDA-MB-231-Col13-/-(28):0.5h,p0.05;1.0h,p0.05;2.0h,p0.05;24h,n.s.)。与westernblot结果一致,胶原XIII敲除的MDA-MB-231细胞荧光素酶活性显著降低(p0.01)。这些实验在MCF-10A细胞系中得到重复,外源性表达的胶原XIII增强TGF-β诱导的Smad2/3磷酸化(0.5h,p0.05;1.0h,p0.05;2.0h,p0.05)及报告基因活性荧光素酶活性(p0.001)。重要的是,整合素β1功能阻断性抗体可显著降低由胶原XIII增强的Smad2/3磷酸化。(5)胶原XIII沉默表达抑制小鼠体内乳腺癌的转移:在肺定植模型中,尾静脉注射对照组细胞的小鼠在5周内出现肺定植,而胶原XIII沉默组小鼠的肺定植情况显著降低(p0.05)。HE染色进一步确认了胶原XIII沉默抑制SCID小鼠体内癌细胞的肺定植(p0.05)。在异种移植乳腺肿瘤模型中,胶原XIII沉默会降低肿瘤的生长速度(day23,p0.05;day25,p0.05),同时肺转移有减少的趋势(p=0.164)。在乳腺癌骨转移模型中,胶原XIII沉默组小鼠乳腺癌的整体转移率低于对照组(p=0.09),但骨转移无显著差异。结论:(1)乳腺癌的发生发展伴随着胶原XIII表达的增加;(2)TNBC细胞中胶原XIII表达的增加通过增强癌细胞迁移和侵袭促进3D培养恶性表型;(3)胶原XIII通过增强癌细胞的干细胞特性和相关的失巢凋亡抵抗促进乳腺癌的发展;(4)胶原XIII通过β1整合素增强TGF-β信号通路,从而促进癌症的发展进程;(5)TNBC中胶原XIII表达的增加可通过增强癌细胞的侵袭和干细胞样特性促进癌细胞的定植和转移;
【图文】：

基底膜

吉林大学博士学位论文2图1.1 基底膜的结构[3]Fig. 1.1 Schematic illustration of a BM[3]图中所示多种聚合物的沉积导致 IV 胶原网络的形成。巢蛋白将层黏连蛋白层和 IV 型胶原网络相连接，也有些文献报道层黏连蛋白和 IV 型胶原网络可以直接相互连接。构成基底膜的其它成分与层黏连蛋白和 IV 胶原网络相连接共同组成细胞基底外侧的基底膜。TypeIVcollagen：IV 型胶原蛋白；Nidogen：巢蛋白；Fibulin：纤连蛋白；Perlecan：基底膜蛋白多糖；Laminins：层黏连蛋白；Receptor：受体[3]。Deposition of this polymer leads to association with type IV collagen network.Nidogen/entactin bridges the laminin polymer and the type IV collagen network, although somestudies have indicated that direct interaction between the laminin polymer and type IV collagennetwork is possible. The other components of the BM interact with the laminin polymer and thetype IV collagen network to organize a functional BM on the basolateral aspect of cells[3].作为肿瘤微环境的重要组成成分，细胞外基质在乳腺癌的发生及发展中发挥重要作用。（1）由于 90%的细胞外基质是由胶原构成的，乳腺癌中最明显的细胞外基质改变就是胶原沉积增多[8]。胶原表达及沉积的增多与乳腺组织硬度及癌症发展密切相关[9]。Liu 等人早在 1995 年就通过表达 I 型胶原 α1 链胶原酶抵抗的基因工程小鼠（Col1α1tm1jae）与鼠乳腺肿瘤病毒启动子驱动的多瘤中间 T 抗原（MMTV-PyMT）转基因小鼠杂交，发现在乳腺癌的发展中出现 I 型胶原沉积增加，从而证明了 I 型胶原沉积和癌症转移的相关性[10]。I 型胶原与组织强度密切相关

模式图,蛋白结构,模式图,胶原

的纤维蛋白折叠方式不同，胶原 XIII 同源三聚体在]。胶原 XIII 属于 II 型跨膜蛋白，，NC1 为跨膜区，[38]。胞外区含有 RRRR 序列，可被内切酶识别切割基质中[42]。人CollagneXIIIα1蛋白由COL13A1（曾经位于染色体 10q22，横跨 140kb；而鼠胶原 XIIIα1 的0B4 上，横跨 135kb[43]。人和鼠的 COLXIIIA1 基因 8 个碱基到 153 个碱基（人）或 144 个碱基（鼠）的剪接相互独立，可影响 COL1、COL3、NC2 和 III 分子的大小及结构域差异很大[40, 44, 45]。人类含0 个外显子，可转录形成 754 个氨基酸构成的蛋白录形成 596 个氨基酸构成的蛋白分子（图 1.2）[44]器官中存在明显差异[44]，目前报道的胶原 XIII 蛋白，说明在不同的组织器官中存在不同的剪接体[46-4
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

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