microRNA-485-5p在结直肠癌中的作用及其调控机制的研究

发布时间：2020-04-15 16:10

【摘要】：【背景】结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是临床常见的恶性肿瘤,严重威胁着人类的健康和生命。目前CRC的病因仍未明确,其可能由于环境与遗传因素长期交互作用而诱发。白细胞分化抗原147(cluster of differentiation 147,CD147),又名细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)、basigin(BSG),是一种广泛存在于细胞表面的跨膜糖蛋白,参与机体多种生理和病理过程。本课题组前期研究证实CD147在CRC组织和细胞株中表达显著增高,通过RNA干扰CD147的表达能够明显抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移能力,提示CD147在CRC的发生发展过程中发挥着重要的作用,然而其详细的调控机制仍有待深入探讨。微小RNA(microRNA,miRNA)是由约22个核苷酸组成的非编码单链小分子RNA,它通过抑制或降解特定靶基因信使RNA(messenger RNA,mRNA),在转录后水平调控基因的表达。鉴于CD147在CRC发生发展中的重要作用及miRNA对靶基因的调控作用,我们通过三种预测软件miRanda,TargetScan和miRDB预测出miR-485-5p可能调控CD147的表达,而miRNA-485-5p在多种肿瘤如口腔鳞状细胞癌、黑色素瘤、肺腺癌、胃癌、乳腺癌等中被报道为抗癌基因,但其在结直肠癌中的功能尚未见报道。因此,本研究旨在探讨miR-485-5p是否影响结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等及其可能的调控机制。【目的】本研究旨在探讨miR-485-5p在结直肠癌中的表达水平及其对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡等表型的影响并验证CD147是否为miR-485-5p的靶基因。【方法】1.CD147相互作用miRNAs的筛选:以BSG基因为检索词,利用三种预测软件miRanda,TargetScan和miRDB预测出可能调控CD147的上游miRNA;2.运用实时荧光定量PCR法(realtime fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测miR-485-5p在2种结直肠癌细胞株(DLD-1、SW480)及正常人类肠黏膜上皮细胞(FHC)中的表达,以及该miRNA和CD147在41例CRC组织及对应癌旁组织中的表达水平;3.通过转染miR-485-5p mimic建立miR-485-5p过表达结直肠癌细胞;4.CCK-8实验、Transwell实验及流式细胞术分别检测miR-485-5p对细胞增殖、迁移和侵袭及凋亡能力的影响;5.建立结直肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,多点注射miR-485-5p agomir及miR-485-5p agomir-NC,观察过表达miR-485-5p对结直肠癌细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响;6.miR-485-5p和CD147在结直肠癌组织中的表达相关性分析采用Spearman相关性分析;7.双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR、Western blot以及挽救实验验证miR-485-5p靶向调控CD147。【结果】1.三种预测软件miRanda,TargetScan和miRDB预测出miR-485-5p可能调控CD147的表达;2.与正常肠粘膜上皮细胞FHC及配对的癌旁组织相比,miR-485-5p在结直肠癌细胞系和组织中低表达,差异有统计学意义;3.转染miR-485-5p mimic可以显著上调结直肠癌细胞中miR-485-5p的表达水平;4.实验性上调miR-485-5p可抑制CRC细胞系的增殖、迁移和侵袭能力,并促进细胞凋亡;5.在裸鼠体内,多点注射miR-485-5p agomir可以抑制结直肠癌细胞SW480的成瘤能力;6.利用Spearman双变量相关分析,分析结直肠癌组织中miR-485-5p与CD147表达的关系,我们发现二者的表达呈负相关,表明CD147可能为miR-485-5p的下游靶基因;7.双荧光素酶报告基因检测显示,miR-485-5p过表达可以抑制野生型荧光素酶活性,但对突变型没有影响,证实miR-485-5p可与CD147的3'端非编码区(3’untranslated region,3'UTR)部分结合;转染miR-485-5p mimic,上调miR-485-5p在结直肠癌细胞中的表达后,qRT-PCR和Western blot均检测到CD147下调;裸鼠移植瘤免疫组织化学染色结果亦显示,与miR-485-5p agomir-NC组肿瘤组织中CD147的高表达相比,miR-485-5p agomir组的肿瘤组织中CD147蛋白表达降低。这些发现均表明CD147和miR-485-5p之间显著负相关,miR-485-5p可以与CD147 3'UTR区特异性结合。挽救实验数据表明,过表达CD147可以部分恢复miR-485-5p对结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡等生物学功能的影响。【结论】在结直肠癌中,miR-485-5p发挥了抑癌基因的功能,可通过CD147抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力并促进细胞凋亡,具有作为基因治疗的潜在价值。
【图文】：

序列,双荧光,报告基因质粒,生物信息学

荧光素酶活性检测们采用碧云天的双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，操作取对数生长期的 293 细胞，接种于 24 孔培养板；待细胞生长密度达到 30%左右，根据 Lipofectamine 2000 试剂说明书进，实验共分 6 组，分组如下：a. PmirGLO 对照质粒， mimic-NC 共转染；b. PmirGLO 对照质粒，miR-485-5p mimic 共转染；图 1 双荧光素酶报告基因质粒构建图注：（a）PmirGLO 报告基因载体图谱简图；（b）生物信息学预测miR-485-5p 3'UTR 结合位点序列及其突变序列

结直肠癌,表达水平,种细胞,图注

图注：U6 为内对照，*P<0.01在结直肠癌细胞中低表达测 3 种细胞株中 miR-485-5p 的表达，实验结果如图LD-1 和 SW480 中，miR-485-5p 的表达水平均显著低果相致，提示 miR-485-5p 的表达下调可能与结RT-PCR 检测结直肠癌及癌旁组织中 miR-485-5p 的表
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

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