多发性骨髓瘤SP细胞分析及相关蛋白ABCG2表达意义研究

发布时间：2020-04-17 05:01

【摘要】：目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种恶性浆细胞疾病,发病率占血液科肿瘤发病率的10%以上,目前治疗手段仍以联合化疗为主,配合靶向治疗及造血干细胞移植,但是放化疗副作用严重影响病人的生存质量,目前生存期约3-5年,且普遍存在着复发耐药的现象。在肿瘤治疗的发展道路上,化疗耐药仍旧是阻碍其进步的绊脚石,在细胞膜上存在一些可以将化疗药物泵出细胞外的“泵”,可以将进入细胞的化疗药物泵出细胞。ABCG2是在研究乳腺癌耐药细胞系时发现的,后来发现它在妇科肿瘤中高表达;消化系统、呼吸系统的腺癌以及白血病等多种肿瘤中均可检测到ABCG2的表达。目前ABCG2已经成为耐药研究的热点,旨在找到逆转耐药的办法。目前关于多发性骨髓瘤ABCG2功能的关键问题尚未有明确解释,比如在多发性骨髓瘤疾病中,ABCG2发挥怎样的生物学功能,是否与疾病的进展相关,对于预后有怎样的意义?又比如它与PTEN是否相关联?ABCG2在多发性骨髓瘤疾病中是否可以发挥肿瘤保护作用,抵抗化疗药物带来的杀伤?以及ABCG2是否可以作为MM肿瘤干细胞的表面标记?在本文中,我们用Hoechst33342将MM细胞染色,用流式细胞仪分选侧群细胞(side population cell,SP cell),并计算出SP细胞所占比例,目的在于鉴定并研究多发性骨髓瘤侧群细胞的干细胞特性,并研究侧群细胞与相关信号通路之间相互调控关系。希望可以发现特异性杀伤SP细胞的靶点,针对特殊靶点探索出新的治疗方案,从而克服传统化疗耐药,改善MM病人的预后。我们用过表达慢病毒来提高MM细胞系ABCG2的表达,建立一个模拟侧群细胞的模型,并应用PI3K/AKT通路抑制剂作用于MM细胞,分析过表达ABCG2前后SP细胞比例变化情况,接下来我们观察了过表达ABCG2前后多发性骨髓瘤细胞对药物的反应及PTEN/PI3K/AKT这一经典信号通路关键分子的变化情况,用以研究多发性骨髓瘤耐药的机制,并试图发现新的治疗靶点,来改善多发性骨髓瘤的治疗效果及预后。我们还利用SiRNA技术使ABCG2表达下调,进一步了解ABCG2的生物学功能及其在调控SP细胞及PTEN/PI3K/AKT信号通路发挥的作用。我们还在MM疾病中分析ABCG2与SP细胞比例及PTEN/PI3K/AKT信号通路之间的关系。我们需要解决的问题是PI3K/AKT信号通路以什么形式参与多发性骨髓瘤的发病以及怎样调节耐药,与ABCG2又存在着什么样的关联,希望找到可行的办法来逆转多发性骨髓瘤的耐药。方法:1、利用流式细胞仪分选多发性骨髓瘤细胞系侧群细胞,检测多发性骨髓瘤细胞系中侧群细胞所占比例。2、分别对分选出的侧群细胞(side population cell,SP cell)及主群细胞(main population cell,MP cell)生物学特性包括细胞周期(PI单染法)、细胞增殖能力(CCK8法)、克隆形成能力(软琼脂集落形成实验)、药物敏感型进行对比,并检测耐药相关蛋白表达情况。3、通过过表达慢病毒感染多发性骨髓瘤细胞,使其高表达耐药相关蛋白ABCG2。4、对比过表达前后SP细胞比例、细胞对化疗药物敏感性的变化,并应用Real-Time PCR及Western blot检测PTEN/PI3K/AKT信号通路相关分子表达变化。5、对比加入PI3K/AKT信号通路抑制剂前后,SP细胞比例、细胞对化疗药物敏感性、PTEN/PI3K/AKT信号通路活性变化情况。6、利用SiRNA干扰多发性骨髓瘤细胞,使ABCG2表达下调。7、对比干扰前后SP细胞比例、细胞增殖速度、细胞对化疗药物敏感性、PTEN/PI3K/AKT信号通路活性变化情况。8、选取临床明确诊断的MM病人标本30例,对照组10例,流式细胞仪分选SP细胞,检测临床病人SP细胞比例,并分析SP细胞与病人临床信息的关系。9、多发性骨髓瘤根据DS分期分组,检测组间SP细胞比例、PTEN、ABCG2及PI3K/AKT信号通路表达情况及其与疾病进展之间的联系。结果:1、在多发性骨髓瘤细胞系中可分选出SP细胞,不同细胞系SP细胞比例不同,NCI-H929,U266两种细胞系所占比例分别为1.79±0.091%、0.4623±0.0095%。2、检测SP及MP细胞周期,发现与MP细胞相比,SP细胞G0/G1期比例明显升高,即大部分处于相对静止期。CCK8法检测SP与MP细胞的相对增殖能力,发现SP细胞具有较快的增殖速度。软琼脂集落形成实验发现SP细胞具有更强的集落形成能力,形成的集落数量明显多于MP细胞。应用CCK8法检测了SP及MP细胞对MM化疗药物的敏感性,发现SP细胞相对不敏感,在相同药物浓度作用下,SP细胞死亡率明显低于MP细胞,SP细胞具有较强的对抗化疗药物的能力。Real-Time PCR检测了SP及MP细胞ABC家族成员表达情况,发现ABC家族成员在SP细胞的表达情况均明显高于MP细胞,尤其是ABCG2,在SP细胞里表达比MP细胞高10余倍。3、过表达病毒感染多发性骨髓瘤细胞后,ABCG2在mRNA及蛋白水平明显高于未感染细胞。4、过表达ABCG2后,ABCG2 mRNA及蛋白水平表达明显升高,细胞对化疗药物的反应性明显减弱,PTEN蛋白表达减低,PI3K/AKT通路活性增强,SP细胞比例亦明显升高。5、过表达ABCG2前后的细胞加入PI3K/AKT通路抑制剂后,发现PI3K/AKT通路活性明显减弱,ABCG2表达明显降低,PTEN蛋白表达增强,SP细胞比例降低,加入抑制剂后细胞对药物的敏感性在一定程度上增强,表现为细胞死亡率明显升高。6、SiRNA干扰可以下调ABCG2的表达,干扰后的MM细胞ABCG2在mRNA及蛋白水平表达明显降低。7、SiRNA干扰后MM细胞增殖能力略有减弱,PTEN表达升高,PI3K/AKT通路活性受到抑制,SP细胞比例降低,同时细胞对化疗药物的反应能力增强。8、30例MM病人体内均可检测到SP细胞,SP细胞比例因人而异,范围0.11-3.73%,发现MM病人SP细胞比例与年龄、性别、ISS分期无关,但与DS分期相关。9、MM病人与对照组比较,PTEN mRNA水平降低,ABCG2 mRNA表达升高,SP细胞比例与PTEN mRNA水平呈负相关,而与ABCG2 mRNA水平呈正相关。按DS分期进行分组统计发现,随着疾病的进展,SP细胞比例随疾病进展升高,PTEN mRNA水平随疾病进展下降。Western blot法检测蛋白表达时发现,PTEN蛋白水平随疾病进展下调,ABCG2蛋白随着疾病进展表达上调,PI3K/AKT通路的活性也随着疾病进展而增强,PTEN蛋白与ABCG2蛋白表达呈负相关。结论:1、在MM细胞系中确实存在SP细胞,MM的SP细胞具有“肿瘤干细胞”样的生物学特点。2、在MM中,过表达的ABCG2负反馈调节PTEN,上调PI3K/AKT通路活性及SP比例,使药物敏感性减低,而通路抑制剂可以抵消过表达ABCG2带来的肿瘤保护作用。3、在多发性骨髓瘤中,ABCG2的下调可负反馈上调PTEN的表达,PI3K/AKT信号通路受抑,SP比例下调,对药物敏感性有所增强。4、在多发性骨髓瘤病人中存在SP细胞,SP细胞所占比例与病人年龄、性别、ISS分期无关,与DS分期相关。且随着DS分期进展,SP细胞比例增加,提示SP细胞比例与疾病进展可能相关。5、多发性骨髓瘤病人PTEN表达减低,ABCG2表达增高,且随着疾病进展,PTEN递减,ABCG2递增,PI3K/AKT通路活性升高,SP比例增加。6、多发性骨髓瘤中ABCG2负反馈降低PTEN表达,通过PI3K/AKT通路发挥其影响SP细胞比例的功能。
【图文】：

散点图,细胞系,比例,多发性骨髓瘤细胞系

多组间比较采用单因素方差分析，两变量的相关程度用双变量相关分析，p<0.05认定差异有统计学意义。3 结果3.1 多发性骨髓瘤细胞系中存在侧群细胞为了证明多发性骨髓瘤细胞系中存在 SP 细胞并分选出 SP 及 MP 细胞，我们选择了两种 MM 细胞系（NCI-H929、U266），，通过流式细胞仪紫外激发光进行分选（波长 350nm）。实验证实在 MM 细胞系中确实有侧群细胞的存在，但 SP 细胞所占比例因细胞系不同而略有差异。在流式散点图上呈现出低染状态，NCI-H929、U266 两种细胞系 SP 细胞所占比例为（1.79±0.091%、0.4623±0.0095%）(图 3.1)。A B C D

细胞,效率

1.85±0.09%、8.94±0.37%；而 U266/MP 细胞分别为：1.60% 、 40.27 ± 0.41% （图 3.2 ）。 G0/G1 期所占细NCI-H929/MP 对比中，差异具有显著性（p<0.05）; U26果，G0/G1 期所占细胞在 U266/SP 及 U266/MP 对比中，差（图 3.3）。SP 细胞大部分处于 G0/G1 期，这与文献报道式分选的效率。A B D E
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.3

【参考文献】