乳腺癌中CDK4蛋白表达对p16蛋白亚细胞定位的影响

发布时间：2020-04-17 20:44

【摘要】：研究背景p16作为肿瘤生物学标志物现已广泛用于临床病理诊断,且p16蛋白胞浆易位多与恶性肿瘤的不良预后相关。本课题组在之前的研究中发现乳腺癌组织中细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinases 4,CDK4)与p16蛋白的亚细胞定位高度一致,主要为胞浆表达或浆核共表达。同时有研究表明,p16蛋白的锚蛋白重复序列中第84位的天冬氨酸(即D84位点)能与CDK4的第24位的精氨酸(即R24位点)通过静电引力结合而发挥作用,并且发现细胞核和细胞浆中均有p16/CDK4蛋白复合体的存在。因此我们推测乳腺癌中p16蛋白胞浆易位与胞浆中p16/CDK4复合体有关,该复合体使得p16蛋白滞留于胞浆,不能进入胞核,致使胞浆p16蛋白表达上调。因此,本研究以乳腺癌BT549细胞为基础,构建稳定表达CDK4、CDK4的R24位点突变体(CDK4R24C,为CDK4第24位的精氨酸CGU突变为半胱氨酸UGU)及CDK4基因表达下调的细胞系,通过细胞免疫荧光及western方法检测CDK4不同表达状态对p16蛋白亚细胞定位的影响,初步探讨p16蛋白亚细胞定位的分子机制。研究目的分析乳腺癌细胞中CDK4蛋白不同表达状态对p16蛋白亚细胞定位的影响,初步探讨p16蛋白亚细胞定位的分子机制。实验方法1.通过细胞免疫荧光,观察乳腺癌BT549和MCF7细胞系中CDK4、p16蛋白的亚细胞定位。2.通过实时荧光定量反转录PCR(Real-time RT-PCR)及western筛选能使CDK4基因表达下调的最佳干扰质粒(干扰质粒pGPU6-sh1、pGPU6-sh2、pGPU6-sh3、pGPU6-sh4由上海吉玛公司构建并合成)。3.构建稳定表达CDK4、CDK4R24C及CDK4基因表达下调的稳转细胞系(质粒pEGFP-CDK4、pEGFP-CDK4R24C由通用生物公司构建并合成)并鉴定稳转系是否构建成功。4.细胞免疫荧光及western检测CDK4不同表达状态时,p16蛋白亚细胞定位的变化。实验结果1.细胞免疫荧光结果发现,乳腺癌BT549和MCF7细胞系中CDK4、p16蛋白均有表达,且p16蛋白主要定位于胞浆或胞浆胞核均有分布,CDK4为胞浆胞核均有分布,两种蛋白存在共定位关系。2.Real-time RT-PCR及western结果显示质粒pGPU6-sh1、pGPU6-sh4的CDK4基因表达下调效果明显,其中pGPU6-sh4最为明显。3.将构建好的稳定表达pEGFP-CDK4、pEGFP-CDK4R24C的细胞系DAPI染色后观察绿色荧光蛋白的表达,结果显示,两种细胞中绿色荧光细胞的比例接近100%,western检测出两种细胞均有GFP蛋白表达,表明稳转系构建成功。4.将构建好的稳定表达pGPU6-sh1、pGPU6-sh4的细胞系提取细胞总蛋白,western检测CDK4的表达,结果显示,上述两种细胞中CDK4蛋白下调明显,其中以质粒pGPU6-sh4的稳转系下调效果最为明显,表明稳转系构建成功。5.细胞免疫荧光及western检测稳定表达pEGFP-CDK4、pEGFP-CDK4R24C及pGPU6-sh4中p16蛋白的亚细胞定位,结果显示CDK4过表达时,p16蛋白在胞浆中表达上调,在胞核中表达下调;CDK4的R24位点突变(CDK4R24C)及CDK4基因表达下调时,p16蛋白在胞浆中表达下调,在胞核中表达上调。结论1.CDK4过表达时p16蛋白在胞浆中表达上调,而在胞核中表达下调。2.CDK4的R24位点突变(CDK4R24C)时p16蛋白在胞浆中表达下调,而在胞核中表达上调。3.CDK4基因表达下调时p16蛋白在胞浆中表达下调,而在胞核中表达上调。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

【参考文献】