SNORD82在肝癌细胞中的表达研究

发布时间：2020-04-19 15:49

【摘要】：目的:本实验研究的主要目的是检测SNORD82在肝癌细胞中的表达,检验其表达量与肝癌细胞侵袭能力的相关性,利用慢病毒转染技术构建SNORD82被稳定抑制表达的肝癌细胞株,为后续功能学试验及靶基因作用原理研究提供理论依据与参考。方法:1、q RT-PCR检测肝癌细胞株(HCCLM3、Hep G2、Huh-7)与正常肝细胞(HL-7702)SNORD82的表达水平;2、构建抑制SNORD82表达的慢病毒载体,包装并感染高表达的肝癌细胞株;3、荧光显微镜观察慢病毒转染效率,q RT-PCR检测SNORD82的表达水平。结果:1、q RT-PCR结果显示:SNORD82在正常肝细胞株(HL-7702)和肝癌细胞株(HCCLM3Hep G2Huh-7)都有检测到。SNORD82在HCCLM3细胞系中相对表达量是5.580±0.121,Hep G2细胞系中相对表达量是3.521±0.130,Huh-7细胞系中相对表达量是1.417±0.120,正常肝细胞(HL-7702)中相对表达量是0.924±0.142,两个组间相互对比,表达量差异明显(P0.05)。SNORD82在四种细胞系中的表达水平从高到低依次为:HCCLM3Hep G2Huh-7HL-7702。2、取4×108TU/ml滴度的SNORD82-RNAi慢病毒,然后感染肝癌细胞株,荧光显微镜观察它的转染效率,得到稳定表达的肝癌细胞株。SNORD82-RNAi慢病毒感染的细胞株定义为KD-HCCLM3,阴性对照病毒感染细胞株定义为NC-HCCLM3。通过荧光实时定量PCR检测3株肝癌细胞(HCCLM3、NC-HCCLM3、KD-HCCLM3)SNORD82的数据表明:SNORD82在HCCLM3细胞中相对表达量是(2.51±0.18),NC-HCCLM3组相对表达量是(2.38±0.21),KD-HCCLM3组相对表达量是(0.527±0.36),HCCLM3组与NC-HCCLM3组对比,差异不显著(P0.05)。KD-HCCLM3组分别同HCCLM3、NC-HCCLM3组对比,其表达量明显降低(P0.05)。结论:1、SNORD82在肝癌细胞中表达上调,且与细胞侵袭转移能力成正相关。2、利用慢病毒转染抑制HCCLM3中SNORD82的表达,成功构建慢病毒细胞株。
【图文】：

图 3.1 GV248 载体 I 进行位点双酶切。82 前体序列：GGAGTATGTTGACCACTGCGCAATCTGAGTGCTTATATGATCAGGTCCCATT 合成引物序列：AGGTGATGGAGTATGTTCTCGAGAACATACT’ACCAGGTGATGGAGTATGTTCTCGAGAACA测序：TGTTAGAGAGANAATTGGATTAATTTGACTGCAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTC

图 3.2 pHelper 1.0 载体图谱 图 3.3 pHelper 2.0 载体图谱（1）质粒转染与慢病毒收获：① 转染前 24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的 293T 细胞，以含 10%血清的培养基调整细胞密度约5 x 106细胞/15 ml，，重新接种10 cm细胞培养皿，37 ℃、5% CO2培养箱内培养。24 h 待细胞密度达 70%～80%时即可用于转染；② 转染前 2 h 更换为无血清培养基；③ 向一灭菌离心管中加入所制备的各 DNA 溶液(GV 载体质粒 20μg、pHelper 1.0 载体质粒 15μg、pHelper 2.0 载体质粒 10μg)，与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为 1 ml，在室温下温育 15 min；④ 混合液缓慢滴加至 293T 细胞培养液中，混匀，于 37℃、5% CO2细胞培养箱中培养；⑤ 培养 6 h 后弃去含有转染混和物的培养基，加入 10 ml 的 PBS 液清洗一
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

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本文编号：2633460