二甲双胍联合索拉非尼影响HepG2干细胞样细胞增殖的研究

发布时间：2020-04-20 01:31

【摘要】：目的1.研究Hep G2干细胞样细胞是否对索拉非尼耐药。2.探索低浓度二甲双胍能否增强索拉非尼抑制Hep G2干细胞样细胞的增殖,并研究其作用原理。方法1.采用无血清干细胞富集培养基对人肝癌细胞系Hep G2进行富集培养,获得干细胞样细胞悬浮球,并在荧光倒置显微镜明场下拍照记录悬浮球生长过程中形态变化,测量悬浮球直径并计算悬浮球数目。收集传代3代以上且悬浮成球生长6天的Hep G2干细胞样细胞,通过流式细胞术检测Hep G2干细胞样细胞表面CD133及CD90分子的阳性表达率。2.将Hep G2干细胞样细胞和Hep G2细胞以1000个/孔(24孔板)的密度种于上层琼脂胶浓度为0.4%,下层琼脂胶浓度为1%的软琼脂胶中,培养13天,比较两组细胞的克隆形成能力。3.采用浓度为5μM、10μM、15μM、20μM、25μM的索拉非尼处理Hep G2细胞和Hep G2干细胞样细胞,分别作用24h、48h和72h,通过CCK8法检测细胞活性,选择最佳药物作用时间,并在荧光倒置显微镜明场下拍照记录悬浮球形态大小及数目变化,以不加药组为对照组比较两组细胞对索拉非尼的敏感性。4.采用浓度为1m M、3m M、5m M的二甲双胍与5μM索拉非尼联合处理Hep G2干细胞样细胞,分别作用24h、48h和72h,通过CCK8法检测细胞增殖活性,同时在荧光倒置显微镜明场下拍照记录悬浮球形态大小及数目变化,以不加药组为对照组计算二甲双胍与索拉非尼联合处理Hep G2干细胞样细胞对Hep G2干细胞样细胞的生长抑制率,并进行统计学分析。选择二甲双胍最佳药物浓度及作用时间。5.采用Western blot法检测Hep G2干细胞样细胞和Hep G2细胞中EMT相关基因Vimentin、Twist1、Snail及E-cadherin的表达。分别采用浓度为1m M、5m M的二甲双胍处理Hep G2干细胞样细胞48h,通过Western blot法检测上述各处理组中Hep G2干细胞样细胞中的EMT相关基因Vimentin、Twist1、Snail及E-cadherin的表达,并进行统计学分析。结果1.富集培养第3d可以观察到悬浮球形成,悬浮球直径及数目会随着培养天数增加而不断增大,但培养悬浮球至第6天左右时,悬浮球数目未见增加,而细胞球直径仍继续增长。Hep G2干细胞样细胞表面CD133分子阳性表达率为(5.59+0.31)%,CD90分子阳性表达率为(9.57+0.29)%;Hep G2细胞表面CD133分子阳性表达率为(0.33+0.32)%,CD90分子阳性表达率为(0.8+0.26)%。两组细胞表面CD133及CD90分子的表达差异均具有统计学意义(t=165.3,P0.001;t=27.99,P0.05)。2.Hep G2干细胞样细胞和Hep G2细胞在软琼脂胶中培养13天,Hep G2干细胞样细胞克隆形成率为(35.5~39.5)%;Hep G2细胞克隆形成率为(17.2~19.0)%,两组细胞之间的差异具有统计学意义(t=25.58,P0.01)。3.索拉非尼处理Hep G2细胞与Hep G2干细胞样细胞的最佳的作用时间为48h。索拉非尼对Hep G2细胞与Hep G2干细胞样细胞的IC50值分别为10.40μM和15.10μM。4.二甲双胍联合索拉非尼处理Hep G2干细胞样细胞最佳的作用时间为48h。浓度为1m M、3m M、5m M的二甲双胍联合5μM索拉非尼处理Hep G2干细胞样细胞48h对Hep G2干细胞样细胞的生长抑制率分别为(27.73+5.52)%、(32.20+4.25)%、(35.11+4.06)%,而5μM索拉非尼单独处理Hep G2干细胞样细胞48h对Hep G2干细胞样细胞的生长抑制率为(22.07+2.17)%。浓度为3m M与5m M的二甲双胍联合5μM索拉非尼与5μM索拉非尼单独用药对Hep G2干细胞样细胞的抑制率差异均有统计学意义(t=4.514,P0.05;t=5.812,P0.01)5.与Hep G2细胞相比Hep G2干细胞样细胞中EMT相关基因Vimentin、Twist1、Snail表达上升,E-cadherin表达下降,差异具有统计学意义(t=4.205,P0.05;t=5.588,P0.01;t=17.70,P0.001;t=10.87,P0.001)。采用浓度为1m M、5m M的二甲双胍分别处理Hep G2干细胞样细胞48h,与未处理组相比其EMT相关基因Vimentin、Twist1,Snail表达下降,E-cadherin表达上升。E-cadherin、Vimentin基因表达只在5m M二甲双胍与未处理组之间有统计学意义(t=6.421,P0.01;t=6.793,P0.01)。不同浓度二甲双胍处理Hep G2干细胞样细胞组Twist1、Snail基因表达均与未处理组差异有统计学意义(t=4.810,P0.05,t=7.923,P0.01;t=6.828,P0.01,t=17.7,P0.001)。结论1.Hep G2干细胞样细胞对索拉非尼敏感性下降。2.低浓度二甲双胍能增强索拉非尼抑制Hep G2干细胞样细胞的增殖,可能与其抑制Hep G2干细胞样细胞的EMT能力有关。
【图文】：

干细胞,富集培养,细胞的

图 1. HepG2 干细胞样细胞的富集培养Figure 1. Enrichment culture of HepG2 stem-like spheres. Enrichment culture of HepG2 stem-like spheres .(A) Typical bright-field cells cultured in stem cell conditioned medium on days 3, 6 and 9. Magnificati

干细胞,细胞表面,肝癌,标志物

图 2.HepG2 干细胞样细胞表面肝癌干细胞标志物的表达Figure 2. Stem cell markers expressed in HepG2 spheres.Figure 2. Stem cell markers expressed in HepG2 stem cell-like cells. CD133 and CD90expression in parental HepG2 cells and spheres on day 12 was examined by flow cytometr
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

【参考文献】