UBA2对结直肠癌增殖的影响及机制研究

发布时间：2020-04-20 14:18

【摘要】：研究背景及意义:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,我国每年新增CRC 37.6万例,且每年新发病例仍在持续增长。结直肠癌的发病机制尚不清楚,遗传学和流行病学等方面的研究认为结直肠癌的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果。遗传因素包括家族性息肉病、遗传性非息肉病、炎症性肠病。大量摄入脂肪、肉类和酒精会增加患结直肠癌的风险。而膳食纤维素及钙的摄入则会降低结直肠癌的患病风险。病因学的研究结果表明腺瘤样息肉是绝大部分结直肠癌的癌前病变。手术治疗及放化疗为治疗结直肠癌的主要手段,但标准化疗失败后的晚期CRC患者,尤其是中国患者,能够选择的有效且可耐受的治疗方案非常有限。因此,阐明结直肠癌的发病机制,寻找有效的分子治疗靶标,进行靶向治疗已成为亟待解决的问题。泛素化修饰是一种最常见的翻译后修饰,是蛋白质在翻译后,通过将泛素分子结合到靶蛋白上,形成多聚泛素链,进而被26s蛋白酶体识别降解。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)是一类类泛素样分子,在结构上与泛素分子相似,也参与蛋白质翻译后修饰,但SUMO化修饰与泛素化修饰使靶蛋白具有截然不同的命运。泛素化修饰介导靶蛋白的蛋白酶体降解,而SUMO化修饰具有可逆性的,参与靶蛋白的定位及功能调节,在细胞分裂、增殖、分化以及衰老等生命进程中发挥重要作用。已有研究表明,SUMO修饰参与肿瘤的发生、发展。UBA2(Ubiquitin-like modifier activating enzyme2)作为SUMO化过程中E1激活酶的重要组分,在SUMO化过程中发挥重要作用。近年来研究发现UBA2在肺癌、肝癌及胃癌组织中表达增高,并且与肿瘤的病理分化程度、增殖、侵袭、转移及耐药性密切相关。然而,UBA2在结直肠癌的发生及发展过程中的作用研究较少。基于UBA2在肺癌、肝癌及胃癌发病中的作用,我们假设UBA2参与了结直肠癌的形成及发展,抑制UBA2表达能有效抑制结直肠癌进展。为了验证上述假设,本研究首先观察UBA2 mRNA和蛋白质在人结直肠癌组织中的表达水平,并分析其表达水平与结直肠癌患者存活率的关系。进而,以RKO和HCT116细胞为研究对象,通过转染si(small interfering)-UBA2,探讨了UBA2对细胞增值的促进作用及机制;并在裸鼠皮下注射si-UBA2-RKO构建人结直肠癌移植瘤模型,观察UBA2在体内对结直肠癌发生、发展的影响。通过以上研究,揭示UBA2在人结直肠癌发生发展中的作用及机制,为结直肠癌的分子靶向治疗提供了新靶点。方法:(1)收集2009-2010吉林大学白求恩第一医院手术切除237例结直肠癌及癌旁组织,懫用实时定量PCR(Real time PCR)和免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)的方法,检测UBA2在癌组织和癌旁组织中的表达;并比较UBA2表达水平与结直肠癌患者预后的关系。(2)体外实验部分:(1)采用慢病毒转染技术将UBA2特异性siRNA转染人结直肠癌细胞RKO和HCT116,通过g418抗性筛选获得稳定低表达UBA2细胞株;(2)采用RT-PCR和Western blot(WB)方法检测稳定低表达UBA2的RKO和HCT116细胞中,UBA2的mRNA及蛋白表达水平;(3)采用MTT、克隆形成实验、PI染色流式细胞细胞术以及Annexin V-APC单染流式细胞术分别检测UBA2对RKO和HCT116细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响;(4)采用WB方法检测UBA2对细胞周期相关蛋白(P21、P27、CyclinB1)、细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、BAD)以及与结直肠癌发生、发展密切相关信号通路(PI3K/Akt信号通路)中关键蛋白p-Akt的表达。(3)体内实验部分:(1)裸鼠皮下注射si-UBA2-RKO细胞构建人结直肠癌移植瘤模型;(2)连续两周每隔一天监测肿瘤生长和体重,隔天用卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积(V)用公式计算:V=L x W2=2;W为宽度,L为长度。结果:(1)与癌旁组织相比,UBA2 mRNA和蛋白在结肠癌癌组织中表达水平显著增高(P0.05);同时我们利用TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库分析了344例结直肠癌和28例正常结直肠组织中UBA2 mRNA的表达水平,与我们的结果一致,UBA2mRNA在结肠癌癌组织中表达水平显著高于正常组织(P0.01)。为了阐明UBA2表达水平与临床预后的关系,我们对237例结直肠癌患者进行了84个月的随访,结果发现病人的肿瘤组织中高表达UBA2的存活率显著低于UBA2低表达者(P0.05)。(2)UBA2的表达依赖于肿瘤的位置、病理分化程度和TNM分期,与年龄、性别、淋巴结及浸润深度无关。(3)体外实验:通过慢病毒转染UBA2特异性siRNA,成功构建了UBA2表达下调的RKO和HCT116结直肠癌细胞系,real time PCR和western blot结果显示,转染UBA2特异性siRNA后,RKO和HCT116细胞的UBA2 mRNA和蛋白水平出现明显降低。MTT和克隆形成结果显示,UBA2表达降低后,RKO和HCT116细胞增殖能力减弱。细胞周期分析结果进一步证实了UBA2表达降低抑制RKO和HCT116细胞的增殖。UBA2表达降低后,RKO和HCT116细胞出现G2/M期阻滞。WB结果显示UBA2表达降低后,CyclinB1表达降低,P21和P27表达明显增高。凋亡结果显示,UBA2表达降低后,RKO和HCT116细胞凋亡增高。Western blot结果显示,Bcl-2蛋白表达和Akt磷酸化水平下调。(4)体内实验:裸鼠皮下注射si-UBA2-RKO细胞构建人结直肠癌移植瘤模型。与对照组相比,UBA2低表达肿瘤的生长速度明显减慢。在荷瘤2周后,将小鼠处死并分离肿瘤,肿瘤重量也进一步说明UBA2低表达可延缓肿瘤生长。结论:(1)UBA2 mRNA和蛋白在人结直肠癌组织中表达上调,与结直肠癌的增殖呈正相关,而与临床预后呈负相关,提示UBA2可能参与人结直肠癌的发生、发展过程。(2)利用低表达UBA2的体外结直肠癌细胞模型,发现UBA2表达下调可使结直肠癌细胞发生细胞周期阻滞、凋亡增加,进而抑制肿瘤细胞的生长。其机制可能与诱导P21和P27表达,下调Cyclin B1、Bcl2、p-Akt表达有关。(3)体内实验结果显示,低表达UBA2的肿瘤在小鼠体内的生长速度明显变缓,说明UBA2的表达与结直肠癌的发生发展呈正相关。提示,UBA2有可能成为结直肠癌靶向治疗的新靶点。
【图文】：

结直肠癌,表达水平

第 3 章实验结果3.1 UBA2 在人结直肠癌组织中的表达及临床意义3.1.1 人结直肠癌组织和癌旁组织中UBA2 mRNA和蛋白的表达水平本研究采用免疫组织化学方法检测 237 例结直肠癌组织和癌旁组织中 UBA2 蛋白的表达水平，real time RT-PCR 检测 33 例结直肠癌组织和癌旁组织中 UBA2 mRNA 的表达水平。结果显示，，与癌旁组织相比，结直肠癌组织中 UBA2 mRNA 表达水平明显增高，差异显著（P<0.05）（图 3.1）。免疫组化结果显示，UBA2 蛋白的阳性产物主要定位于细胞核中，呈不同程度的黄色至棕褐色颗粒，与癌旁组织相比，结直肠癌组织中 UBA2 蛋白的表达水平显著增高（图 3.2）。

结直肠癌,临床病理特征,相关性,患者

3.2 结直肠癌组织和癌旁正常组织中 UBA2 蛋白的表达水平2 protein expression in adjacent normal colorectal tissue (A) and CRC ti癌UBA2蛋白的表达与临床病理指标的相关性表 3.1 结直肠癌患者临床病理特征分析 Clinicopathological characteristics of patients with colorectal canathologicalatureUBA2 expressionTotal P-valuNegative Positivef patients 35 202 237s) 0.11020 86 10615 116 1310.05824 98 122e 11 104 115
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

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