PGRN在食管癌淋巴管生成中的作用及其对患者预后的影响

发布时间：2020-04-23 08:04

【摘要】：研究背景食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。近年来,虽然食管癌的诊断和治疗方法有所进步,但患者的总体预后仍不理想。在食管癌侵袭转移过程中,淋巴管生成、淋巴结转移发挥了重要作用,是影响食管癌患者预后的独立危险因素之一。然而,目前关于食管癌淋巴管生成的机制尚不明确。PGRN(progranulin)是类生长因子样分泌蛋白,在神经营养、炎症反应等方面发挥重要作用。在肿瘤中,PGRN被发现在结直肠癌和卵巢癌等肿瘤中高表达,与患者的不良预后密切相关。PGRN主要通过细胞内蛋白激酶B(PKB/AKT)、细胞外信号调节激酶(ERK)等信号通路在肿瘤的增殖、迁移、血管生成和恶性转化等方面发挥作用。但是,食管癌中PGRN的表达情况及其对食管癌淋巴管生成作用的影响,尚不清楚。VEGF-C是调节肿瘤淋巴管生成的重要因子,可以通过激活VEGFR-3促进淋巴管的形成和生长,与食管癌等肿瘤组织中的淋巴管密度(LMVD)和淋巴结转移密切相关。有意思的是,研究发现,VEGF-C是磷酸化的ERK、AKT和JNK通路的下游信号。PGRN对这些信号通路的调控是否可以影响VEGF-C的表达,从而影响食管癌的淋巴管生成等问题亦有待研究。研究目的明确PGRN在食管癌中的表达情况,探讨其对食管癌淋巴管生成的作用及其可能机制,分析PGRN在食管癌中的表达对患者预后的影响并建立预后预测模型。研究方法1.RT-PCR、Western blot检测PGRN及淋巴管生成因子VEGF-C在不同EC细胞系包括TE-1,Eca109,K410,K450中的表达。2.免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测PGRN在食管癌组织的表达,并进一步分析食管癌组织中PGRN表达与患者临床参数的关系。检测Ki67和D2-40在食管癌组织中的表达,并分析PGRN与ki67表达和淋巴管密度(LMVD)、淋巴管侵犯(LVSI)的相关性。3.用p-GPU6/GFP/Neo/PGRN质粒或空载体转染食管癌细胞TE-1,获得干扰PGRN表达的食管癌细胞TE-1-PGRN-sh及对照细胞株TE-1-NC-sh;用pEZ-M61/GFP/PGRN质粒或空载体转染食管癌细胞TE-1,获得过表达PGRN的细胞株 TE-1-PGRN-vector 及对其照细胞株 TE-l-NC-vector。RT-PCR、Western blot确定转染效率。在TE-1细胞中分别下调和上调PGRN表达后,使用PT-PCR、Western blot方法检测VEGF-C的变化。4.磷酸化ERK、AKT和JNK被认为是VEGF-C的上游信号。Western blot方法检测PGRN对ERK、AKT和JNK磷酸化水平的影响,并筛选出PGRN-vector对这些上游信号的效果。筛选出通路信号靶点后,加入相应的通路阻滞剂,检测PGRN诱导的VEGF-C表达的变化,以明确PGRN调节VEGF-C的信号通路。5.免疫组织化学检测VEGF-C、p-ERK、AKT、p-AKT在食管癌组织中的表达,并分析 PGRN 与 VEGF-C、p-ERK、AKT、p-AKT 的相关性。6.应用Kaplan-Meier曲线分析高PGRN和低PGRN表达食管癌患者的总生存期(overall survival,OS)和无进展生存期(progression free survival,PFS),并应用Log-rank方法进行统计学分析。7.应用Cox回归风险模型分析患者OS的独立危险因素,并建立列线图预后预测模型。研究结果1.PGRN在食管癌细胞系中的表达及其与VEGF-C表达的相关性RT-PCR检测发现PGRN在食管癌细胞系TE-1,Eca109,K410,K450中均有表达;Western blotting检测发现,除K410外,其他食管癌细胞系中均有不同程度的PGRN表达。RT-PCR 和 Western blot检测证实,VEGF-C 与 PGRN 在 TE-1,Eca109,K450细胞中共表达。提示,在食管癌中PGRN和VEGF-C的表达存在相关性。2.上/下调TE-1细胞中PGRN的表达对VEGF-C表达的影响分别应用 PGRN-vector 和 siRNA(PGRN-shl,PGRN-sh2 和 PGRN-sh3)上、下调TE-1细胞中PGRN表达,RT-PCR和Western blot检测发现VEGF-C的表达呈相同的变化趋势。3.TE-1细胞中PGRN对VEGF-C的表达调控可能通过p-ERK和p-AKT通路实现上调PGRN表达后,TE-1细胞中p-ERK,p-AKT和VEGF-C的表达上升,ERK,AKT,JNK,p-JNK的表达无明显变化。进一步研究发现,加入p-ERK抑制剂U0126可以阻断PGRN对p-ERK和VEGF-C的诱导效应;加入p-AKT抑制剂LY294002可以减弱PGRN对p-AKT和VEGF-C的诱导作用。因此,PGRN可能通过p-ERK和p-AKT信号通路调控食管癌细胞中VEGF-C的表达。4.PGRN在食管癌组织中的表达与患者淋巴结转移、LMVD及LVSI密切相关我们收集了 96例食管癌患者的肿瘤标本和这些患者的临床病理资料。研究发现,PGRN高表达的患者比低表达患者淋巴结转移几率明显增高(69%VS46%,P=0.03),但是PGRN的表达和患者年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度、病理类型、肿瘤分级等临床病理参数无相关性。PGRN高表达的患者同时表达高水平的D2-40(LMVD的标志物)(P=0.016),具有较高的LVSI阳性率(67%vs46%,P=0.04)。PGRN的表达与肿瘤组织LMVD(r=0.30,P=0.003)、LVSI(r=0.21,P=0.039)密切相关。5.PGRN在食管癌组织中的表达与VEGF-C、p-ERK及p-AKT密切相关高表达PGRN的患者也表达较高水平的VEGF-C(P0.001),p-ERK(P0.001),和 p-AKT(P=0.035),且 PGRN 的表达与 VEGF-C(r=0.39,P=0.001),p-ERK(r=0.33,P=0.001)和p-AKT(r=0.30,P=0.03)的表达正相关。因此,体内研究证实,PGRN可能通过p-ERK和p-AKT调控VEGF-C的表达,促进食管癌的淋巴管生成和淋巴结转移。6.PGRN在食管癌中的表达对患者生存的影响Kaplan-Meier曲线显示高表达PGRN的患者的OS及PFS较低表达者均显著缩短。Cox风险模型分析提示高PGRN表达的患者比低PGRN表达的患者死亡风险高1.99倍(95%的可信区间1.05～3.78,P=0.035);疾病进展风险提高2.88倍(95%可信区间:1.55～5.35,P=0.001)。7.食管癌患者预后预测模型的建立Cox回归风险模型分析显示,TNM分期(hazard ratio:2.64,95%可信区间1.07～6.50;P=0.035),淋巴结转移(hazard ratio:1.31,95%可信区间 2.26～7.56;P0.001),PGRN 表达水平(hazard ratio:1.36,95%可信区间 1.05～1.77;P=0.022),ERK 磷酸化程度(hazard ratio:1.42,95%可信区间 1.07～1.89;P=0.016)是食管癌死亡的独立危险因素。基于这四项独立预后因素建立列线图模型,可用于食管癌患者的预后评估。结论1.PGRN在食管癌高表达,与食管癌的淋巴管生成、淋巴结转移密切相关。2.PGRN可能通过p-AKT、p-ERK信号通路诱导VEGF-C的表达,发挥促进食管癌淋巴管生成、淋巴结转移的作用。3.PGRN高表达与食管癌患者不良预后相关,是食管癌患者独立预后因素之一。4.基于TNM分期、淋巴结转移、PGRN表达、ERK磷酸化程度建立的列线图模型可以用于食管癌患者的预后评估。
【图文】：

图１邋ＰＧＲＮ在４种食管癌细胞系中的表达逡逑Ａ．邋ＲＴ－ＰＣＲ邋检测邋ＰＧＲＮ邋在邋ＴＥ－ｌ，Ｅｃａｌ０９，邋ｋ４１０，ｋ４５０邋细胞系中的表达，ＧＡＰＤＨ邋ｍＲＮＡ逡逑作为内对照；Ｂ．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋检测邋ＰＧＲＮ邋在邋ＴＥ－１，Ｅｃａｌ０９，，邋ｋ４１０，邋ｋ４５０邋细胞逡逑系中的表达。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑

本文编号：2637527