RMP在食管鳞状细胞癌增殖中的作用机制研究

发布时间：2020-04-23 09:52

【摘要】：食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,我国是食管癌高发国家之一,在全世界范围内,每年被确诊食管癌的患者中,我国患者大约占全世界的50%。研究表明,RMP(RPB5-Mediating Protein)的异常表达在肝癌、卵巢癌等肿瘤的发生发展中起到重要的作用。RMP可能通过影响增殖、凋亡、周期等相关关键因子从而发挥一个潜在癌基因的功能。我们一方面通过测定RMP在食管鳞癌中的表达来研究其对食管鳞癌细胞生物学功能的影响;另一方面,通过临床数据,探究RMP在判断食管鳞癌预后及评估术后化疗中的疗效。探寻RMP在食管鳞癌的发生发展中起到的作用,有望为食管鳞癌的预后和评估提供新的标记物。一、RMP在食管鳞癌中的表达及其对细胞生物学功能的影响目的:通过测定RMP在人食管鳞癌组织和细胞系中的表达水平,来研究RMP与肿瘤病人临床病理特征的联系,同时探索其对食管鳞癌细胞生物学功能的影响,为食管鳞癌的基因靶向治疗提供强有力的依据。鉴于这些实验,我们在这项研究中检测了RMP在食管鳞癌中的表达,已经敲低或者过表达RMP对食管鳞癌细胞的增殖、侵袭的影响等细胞行为,以及对放化疗的敏感性。在临床水平,我们研究了RMP对食管鳞癌预后及评估术后化疗疗效。通过这项研究,我们有望对食管鳞癌的发生发展的机制有更深一步的认识,为发现食管鳞癌新的分子标记物和预后判断提供新的证据。方法:1.通过q RT-PCR检测RMP在食管鳞癌细胞系和正常细胞系中的m RNA表达水平,同时用western blot检测RMP相应的蛋白表达水平。2.通过q RT-PCR检测RMP在人食管鳞癌组织和相应癌旁组织中的m RNA表达水平,同时用western blot检测RMP相应的蛋白表达水平。3.通过q RT-PCR检测RMP在不同特征食管鳞癌组织样本中的m RNA表达水平,分析其与肿瘤临床病理特征的联系,同时用表格统计病人的相关临床信息。4.荧光显微镜检测各组RMP质粒在食管鳞癌细胞Eca109和Ec9706中的瞬时转染情况,同时用q RT-PCR和western blot检测转染效率。5.通过CCK-8试验检测RMP对Eca109和Ec9706细胞增殖的影响。6.用不同浓度的吉非替尼处理转染了各组不同RMP质粒的Eca109和Ec9706细胞,通过CCK-8试验、流式细胞术检测RMP对Eca109和Ec9706细胞化疗敏感性的影响。7.通过CCK-8试验、流式细胞术检测RMP对Eca109和Ec9706细胞放疗敏感性的影响,同时用western blot检测细胞凋亡相关基因的蛋白表达水平。8.通过流式细胞术检测RMP对于Eca109和Ec9706细胞周期的影响,同时用western blot检测周期相关基因的蛋白表达水平。9.通过迁移和侵袭试验检测RMP对Eca109和Ec9706细胞迁移和侵袭能力的改变。10.通过裸鼠皮下移植瘤实验观察RMP对移植瘤生长情况的影响,同时用免疫组化检测RMP、Bax、Bcl-2和capase-3的蛋白表达情况。11.对临床病人数据随访分析,研究RMP对食管鳞癌预后及评估术后化疗疗效。结果:1.q RT-PCR和western blot实验结果显示:无论是m RNA和蛋白表达水平,RMP在食管鳞癌细胞系中均呈相应的高表达状态。2.q RT-PCR和western blot实验结果表明:与癌旁组织相比,RMP在人食管鳞癌组织中的m RNA和蛋白的表达水平均明显提高。同时发现RMP的表达与肿瘤组织的淋巴结和T-stage状态有关,与病人的年龄、性别和肿瘤类型无关。3.荧光显微镜、q RT-PCR和western blot实验表明:各组RMP质粒在Eca109和Ec9706细胞中瞬时转染顺利,m RNA和蛋白表达水平呈相应的提高。4.CCK-8试验表明:RMP明显促进Eca109和Ec9706细胞的增殖。5.CCK-8试验表明:在化疗药物剂量逐渐增加的作用下,RMP仍能够减缓Eca109和Ec9706细胞的死亡;流式细胞术检测表明:RMP能够减少化疗引起的细胞凋亡。6.CCK-8试验表明:在辐射剂量逐渐增加的作用下,RMP仍能够减缓Eca109和Ec9706细胞的死亡;流式细胞术检测表明:RMP能减少放疗引起的细胞凋亡;western blot实验检测表明:在放疗后,RMP能够抑制Eca109和Ec9706细胞中凋亡相关基因蛋白的表达,促进抗凋亡相关基因蛋白的表达。7.流式细胞术检测表明:RMP能够减少由放疗引起的Eca109和Ec9706细胞周期G2期的阻滞,同时western blot实验表明:放疗后,RMP能够调节Eca109和Ec9706中细胞周期相关基因蛋白的表达。8.迁移和侵袭试验表明:RMP能够促进Eca109和Ec9706细胞的迁移和侵袭能力。9.裸鼠皮下移植瘤实验表明:RMP能够促进移植瘤的生长,同时免疫组化检测表明:RMP能够抑制凋亡相关基因蛋白的表达,促进抗凋亡相关基因蛋白的表达,从而促进肿瘤的生长。10.临床数据的统计分析结果显示RMP高表达提示食管鳞癌生存期短,可能是预后差的一个指标,并可能提示对铂类药物耐药。结论:1.RMP在人食管鳞癌中呈高表达的状态,说明RMP可能与食管鳞癌的生长和恶性程度有着密切的联系,是潜在的一种食管鳞癌相关促癌基因。2.RMP的过表达能够改变Eca109和Ec9706如细胞增殖、凋亡、周期、迁移和侵袭等各项生物学功能,促进移植瘤的生长,进一步表明RMP在食管鳞癌中扮演着癌基因的角色,为我们对食管癌的基因靶向治疗又提供一个强有力的目标。二、RMP判断食管鳞癌预后及评估术后化疗疗效的研究目的:本研究旨在分析食管鳞癌RMP的表达率,探讨其表达对食管鳞癌的预后的影响,及其与晚期食管鳞癌含铂类方案化疗疗效的相关性。方法:统计分析采用SPSS13.0统计软件。生存分析采用Kaplan-Meier方法,组间比较应用Log-rank检验,预后分析采用COX风险比例回归模型。RMP与化疗疗效关系采用计数资料比较采用X,检验。取P0.05为具有统计学意义标准。免疫组织化学法对共59例患者的石蜡标本切片进行检测RMP的表达情况,检测RMP在不同患者中的表达水平。结果:本组114例食管鳞癌患者单因素分析总生存期:淋巴结转移数目、肿瘤新分期、RMP表达、是否化疗、肿瘤分化程度、抽烟及BMI对OS有显著影响的因素,P值分别为0.003,0.032,0.039,0.018,0.022,0.034,0.069。多因素分析结果:只有肿瘤分期是独立的预后因素,P值为0.016。RMP的P值为0.089,未见统计学差异。单因素分析无病生存期,结果显示:肿瘤分期、淋巴结转移数目,RMP表达,脉管瘤栓和ECOG,P值分别为0.034,0.001,0.007,0.038,0.058。具有统计学差异。多因素分析:只有分期和ECOG评分是独立的预后因素,P值为0.019,0.037。单因素分析无进展生存期结果:化疗疗效、化疗周期数、是否顺铂足量化疗、性别、抽烟,P值分别为0.001,0.012,0.045,0.022,0.016。多因素分析:只有化疗疗效、是否顺铂足量化疗是独立的预后因素,P值分别为0.000,0.043。RMP表达与晚期食管鳞癌含顺铂方案化疗疗效未看到统计学相关性,但亚组分析顺铂足量化疗患者RMP表达与化疗疗效进行卡方检验,P值为0.038,具有显著统计学差异,提示RMP阳性者可能顺铂耐药,生存期短,但尚需进一步证实。结论:RMP高表达提示食管鳞癌生存期短,可能是预后差的一个指标,并可能提示对铂类药物耐药。
【图文】：

食管鳞癌,食管,细胞

细胞癌中的表达状细胞癌细胞系中的表达情况细胞，分别为正常食管上皮细胞用上述引物，取各组细胞总 RNA2.0反应[39]。测定3组细胞RMP的mRNP 在食管鳞癌细胞 Eca109 和 Ec970EEC 中的表达水平(p<0.05)，图 2一抗，以及 HRP 标记的二抗进行现食管鳞癌细胞 Eca109 和 Ec9706 中EC。以上结果表明：在细胞水平中，现为相对于人的正常食管上皮细胞明显的高表达，预示它可能参与食管

食管鳞癌,食管,细胞

图 2 正常食管细胞和食管鳞癌细胞中 RMP 的蛋白水平MP 在食管鳞状细胞癌病人组织和相应癌旁组织中的表达情况医院手术临床样本，分别为人食管鳞癌组织和相邻癌旁组织，，提取各组织样本中的 RNA，以 RNA2.0μg 做为模板，按照T-PCR 反应。测定二组样本中 RMP 的 mRNA 水平和蛋白表达发现 RMP 在人食管鳞癌组织中的 mRNA 水平明显高于其相(p<0.05)，图 4 按上述方法裂解组织提取蛋白，用 RMP 抗体P 标记的二抗进行 Western blot 检测，在蛋白水平进行了验临床人食管鳞癌组织和相邻癌旁组织 RMP 无论是在基因的水平，表现为在食管鳞癌组织中呈明显的高表达，预示着它生相关，且临床样本实验结果和细胞中 RMP 的表达水平结果
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1

【参考文献】