通过定量蛋白质组学技术筛选出PDLIM5可作为甲状腺乳头状癌的潜在标志物

发布时间：2020-04-27 14:54

【摘要】：目的近年来甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)发病率持续升高。虽然大部分PTC分化程度高、预后良好,但仍有一部分会复发及远处转移,严重影响患者的健康。此外,部分对传统的化疗药物不敏感的患者往往也有着不良的预后。因此,目前急需寻找新的药物治疗靶点。本研究旨在寻找新的有望成为PTC治疗靶点的PTC标志物。方法采用手术切除的经病理诊断确诊的6例PTC患者的癌症组织及邻近的正常甲状腺组织,通过无标记定量蛋白质组学技术分析蛋白质表达情况,鉴定出癌症组织与正常甲状腺组织的差异表达蛋白,并通过生物信息学对差异表达蛋白进行功能注释及通路分析。通过生物信息学分析从差异表达蛋白中选取了具备成为PTC标志物可能性的PDZ-LIM结构域蛋白5(PDZ and LIM domain 5,PDLIM5)和PDZ-LIM结构域蛋白1(PDZ and LIM domain 1,PDLIM1),以及已被证实在PTC中呈高表达的S100钙结合蛋白A11(S100 calcium binding protein A11,S100A11),在临床组织样本中采用Western blot和qRT-PCR进行表达验证。采用定量斑点印迹分析(Quantitative dot blot analysis,QDB)技术在75对临床组织样本中对PDLIM5和PDLIM1的蛋白质表达水平进行检测,并对结果进行ROC曲线分析。基于ROC曲线分析与蛋白质的表达水平以及qRT-PCR结果,选择在转录水平与蛋白水平稳定高表达的PDLIM5确定为候选标志物进行深入研究。用IHC技术分析PDLIM5蛋白在PTC癌组织与正常甲状腺组织样本中的表达,统计分析IHC检测的PDLIM5的表达量与病人性别、年龄、肿瘤大小、以及淋巴结转移之间的关系。采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在PTC细胞系上降低PDLIM5蛋白的表达,通过实时细胞增殖实验、平板克隆形成实验、细胞划痕迁移实验和Transwell侵袭实验检测沉默PDLIM5后对PTC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,以探讨PDLIM5作为PTC治疗靶标的潜在价值。通过Western blot检测沉默PDLIM5表达对PTC中重要的通路Ras/ERK信号通路中相关信号通路蛋白Ras、Raf-1和p-ERK1/2蛋白以及侵袭转移相关蛋白基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)表达的影响,以探寻PDLIM5在PTC中作用的可能机制。结果通过高通量高分辨率质谱分析,我们在PTC筛选到了2788种蛋白质,比以往任何一种在PTC中进行质谱分析的得到的蛋白质数量都要多。其中,49种蛋白质在PTC患者肿瘤组织与正常甲状腺组织中表达具有显著性差异。在PTC组织中高表达的有44种,在正常甲状腺组织中高表达的有5种。通过生物信息学分析,发现这些异常表达的蛋白质主要是细胞骨架蛋白与核酸结合蛋白,说明骨架蛋白在PTC的发生中起着重要作用。其分子功能主要是蛋白结合功能,主要参与促性腺激素释放受体信号通路与细胞周期信号通路。生物信息学分析结果显示,骨架蛋白PDLIM5和PDLIM1具有成为PTC标志物的潜质。对PTC患者的癌组织与正常甲状腺腺体组织中的PDLIM5和PDLIM1以及已知在PTC组织中高表达作为对照的S100A11蛋白,进行Western blot验证,结果显示这三种蛋白在癌组织中表达均较正常甲状腺组织中显著性升高;qRT-PCR验证结果显示PTC组织中PDLIM5、PDLIM1和S100A11 mRNA的相对表达量(3.07±0.41,1.65±0.35,3.68±1.05)均显著性高于正常腺体组织。Western blot与qRT-PCR结果与质谱分析结果相一致,证实了我们高通量高分辨率质谱分析的有效性。为了进一步研究PDLIM5及PDLIM1在PTC中的蛋白相对表达量,我们采用QDB技术在75对临床样本中进行蛋白检测。结果显示,有54例PTC样本癌组织中PDLIM5蛋白呈显著性高表达,56例PTC组织中PDLIM1蛋白呈显著性高表达。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线分析结果显示,PDLIM5的AUC是0.87(P0.001;95%CI 0.817-0.927),PDLIM1的AUC为0.70(P0.001;95%CI 0.61-0.78),PDLIM5在PTC中的灵敏度与特异性更好。结合Western blot与qRT-PCR结果,PDLIM5蛋白从转录水平到蛋白表达水平在PTC癌组织中均呈显著性高表达且表达稳定更具成为PTC生物标志物的潜质。对PTC组织进行PDLIM5蛋白的IHC检测结果显示,PDLIM5主要分布于胞浆中,细胞膜上也有部分分布。统计分析表明,78例PTC患者标本中有62例(79.5%)癌组织的PDLIM5蛋白表达量显著性高于其对照的正常甲状腺组织。进一步对PDLIM5蛋白的表达与患者病理特征的统计学分析结果显示,PDLIM5的表达与肿瘤的大小呈正相关,与患者的年龄、性别、淋巴结转移不相关。在PTC细胞株中敲除PDLIM5表达后,可以显著性地抑制细胞增殖、迁移及侵袭能力。敲低PDLIM5表达后,相关通路蛋白表达分析结果显示:Ras/ERK信号通路中的Ras、Raf-1和p-ERK1/2蛋白的表达显著性下调,侵袭转移相关蛋白MMP-9蛋白表达水平也呈显著性降低。结论:我们通过高通量高分辨率质谱分析结合生物信息学分析并通过在临床样本中进行验证,筛选出具备成为PTC标志物潜质的PDLIM5。其在临床组织样本中呈高表达并与PTC的发生发展相关,在PTC细胞系中敲低PDLIM5可以抑制细胞的恶性生物学行为。因此,PDLIM5具有作为PTC治疗靶标的潜在价值。
【图文】：

质谱分析,火山,热点,蛋白质

图 1.1 质谱分析鉴定出的蛋白质左边是火山图，，右边为鉴定出的部分蛋白质的热点图ig1.1 Proteins identified through proteomics. The left fig:Volcano plot illustrated significantifferential abundant proteins from the quantitative analysis. The -log10 (P value) is plottedagainst the log2 (fold Cancer/Normal). The red dots indicate proteins with significantlyfferent expression between PTC and normal thyroid tissue（sP<0.05）. The black dots indicateroteins not significantly different. The right is heatmap generated by hierarchical clusteringof proteins identified表 1.4 甲状腺癌组织与正常甲状腺组织的差异表达蛋白Tab1.4 Differential expressed proteins between PTC tissues and normal thyroid tissues（Triplicate experiments of 6 pairs of tissue）tein IDs Protein Names P value RatioQ99460 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1 3.51E-3 5.43P00352 Retinal dehydrogenase 1 4.27E-3 0.62

生物学过程,差异表达,分子,信号通路

30图 1.2 差异表达蛋白的蛋白分类、细胞组分、分子功能和生物学过程Fig1.2 Global protein profiling of differentially expressed proteins between PTC tissuesand normal thyroid tissues. GO analysis of (a) cellular components (b) molecularfunction (c).biological processes and (d) protein class 信号通路注释结果通过检索发现，这些蛋白质主要参与到 14 个代谢通路（图 1.3）。这些通路
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R736.1

【参考文献】