DEK原癌基因在星形细胞肿瘤中的表达及其对U251细胞增殖和凋亡的影响

发布时间：2020-05-04 08:52

【摘要】：目的:星形细胞肿瘤具有浸润性生长及易复发等特点。尽管神经外科手术以及术后放疗、化疗技术有了显著的进步,但星形细胞肿瘤患者的中位生存时间未得到明显延长。近年来,基因靶向治疗在治疗肿瘤等疾病中发挥了重要作用。与此同时,靶向星形细胞肿瘤的基因治疗也在临床中显示良好的应用前景。DEK是一类原癌基因,在急性髓细胞白血病中首次被发现。EDK还在其他多种恶性肿瘤中高表达,如肝细胞癌、喉鳞癌及恶性黑色素瘤等。高表达的DEK促进肿瘤的恶性生物学行为,并介导恶性黑色素瘤的抗药性。目前尚无文献报道DEK在不同病理级别的星形细胞肿瘤中的表达水平。同时,未见文献报道DEK是否可以调控星形细胞肿瘤细胞的生物学行为及可能的调控机制。本研究目的在于从分子水平检测星形细胞肿瘤中DEK基因的mRNA和蛋白的表达水平,分析其表达水平与星形细胞肿瘤WHO病理级别的关系,探讨其在星形细胞肿瘤细胞恶性生物学行为中的调控作用,从而为星形细胞肿瘤的基因靶向治疗提供实验依据。方法1、应用RT-PCR法检测DEK mRNA在星形细胞肿瘤组织中的表达水平。2、应用Western blot法检测DEK蛋白在不同病理级别的星形细胞肿瘤临床样本中的表达水平。3、应用免疫组织化学染色法检测DEK蛋白在星形细胞肿瘤组织中的分布和表达。4、RT-PCR法检测经小干扰RNA(Small interefering RNA,siRNA)基因沉默后,DEK mRNA在U251细胞中表达水平的变化。5、Western blot法检测经siRNA基因沉默后,DEK蛋白在U251细胞中表达水平的变化。6、检测DEK基因沉默后对于U251细胞生长能力的影响。7、检测DEK基因沉默后对于U251细胞凋亡和细胞周期的作用。8、应用Western blot法检测DEK基因沉默后,U251细胞中P53、P21、Bcl-2和C-myc蛋白质表达水平的变化。9、检测DEK基因沉默对于U251细胞内Caspase-3活性的影响。结果1、DEK mRNA和蛋白在正常脑组织中表达水平极低,而在星形细胞肿瘤组织中表达水平增高,其表达水平与星形细胞肿瘤WHO病理级别正相关,高级别星形细胞肿瘤(III、IV级)中DEK的表达水平显著高于低级别星形细胞肿瘤(I、II级)。2、DEK在星形细胞肿瘤临床样本中的阳性率显著高于其在正常脑组织临床样本中的阳性率,DEK蛋白主要分布于星形细胞肿瘤的细胞核中,随着肿瘤病理级别的增高,DEK表达强度增强,低级别组与高级别组间有显著差异。3、siRNA-DEK转染的U251细胞中DEK mRNA和蛋白表达水平显著低于未转染组和阴性对照组,阴性对照组与未转染组DEK mRNA和蛋白表达水平无显著性差异。4、siRNA-DEK转染24h后,U251细胞的生长速率开始显著下降,72h达到最低,未转染组和阴性对照组间细胞生长速率无显著性差异。5、siRNA-DEK转染后,U251细胞的凋亡率显著高于未转染组和阴性对照组,U251细胞增殖指数显著低于未转染组和阴性对照组。6、siRNA-DEK转染后,U251细胞内P53和P21蛋白表达显著上调,Bcl-2、C-myc蛋白表达下调,而在未转染组和阴性对照组表达无明显改变。7、与未转染组和阴性对照组相比,siRNA-DEK转染组U251细胞中Caspase-3活性显著升高。讨论针对星形细胞肿瘤的靶向治疗主要包括以下几个方面:干扰肿瘤细胞的细胞周期进程、促进肿瘤细胞凋亡;应用前药转换酶的靶向治疗;应用免疫方法增强机体对肿瘤细胞的免疫识别能力。其中,选择适宜的基因靶点是其中最为关键的一步。研究发现DEK原癌基因在多种肿瘤中呈高表达状态,但尚未见有关DEK在星形细胞肿瘤组织中表达水平的文献报道。在本研究中,首先检测DEK蛋白在星形细胞肿瘤临床样本中的分布与表达,实验结果显示:与正常脑组织相比,DEK蛋白在星形细胞肿瘤临床样本中显著高表达,并与肿瘤WHO病理级别正相关。DEK主要分布于星形细胞肿瘤的细胞核中。为了进一步证实以上关于DEK在星形细胞肿瘤组织中表达水平的研究结果,我们采用siRNA-DEK转染U251细胞,检测DEK基因沉默对其生物学特性的影响。实验结果显示:在siRNA-DEK转染组,DEK mRNA和蛋白表达水平显著降低,细胞的生长速率显著下降,细胞增殖指数显著降低,细胞的凋亡率则显著增高。说明DEK基因表达下调能够抑制星形细胞瘤细胞系体外增殖能力,使细胞生长受抑,生长速度减缓,提示DEK与胶质瘤发生、发展关系密切,可以作为肿瘤基因治疗的候选靶点。同时,我们还发现,siRNA-DEK干扰DEK表达后,凋亡抑制基因Bcl-2受抑,p53及其下游调控基因p21表达均上调,活化Caspase-3诱导肿瘤细胞发生凋亡,表明p53依赖性细胞凋亡途径在DEK原癌基因调控星形细胞肿瘤发生、发展中发挥重要作用。DEK基因沉默后,C-myc蛋白表达也明显下调,表明DEK可能通过反式激活作用来激活c-myc癌基因参与细胞转化和肿瘤发生。结论1、DEK mRNA和蛋白在星形细胞肿瘤中表达上调,其阳性率及表达水平均与星形细胞肿瘤WHO病理级别正相关;2、利用基因沉默技术设计合成的靶向siRNA-DEK,能有效地在U251星形细胞瘤细胞内实现基因沉默效应;3、siRNA-DEK下调DEK基因表达后,U251细胞生长减慢,细胞凋亡增加,细胞增殖受抑;4、siRNA-DEK下调DEK基因表达后,凋亡抑制基因Bcl-2受抑,p53及其下游调控基因p21表达均上调,Caspase-3活性增加;5、DEK基因下调引起的p53和p21转录激活可负调节细胞周期,使U251细胞周期阻抑;6、siRNA-DEK下调DEK基因表达后,C-myc蛋白表达也明显下调,表明DEK可能通过反式激活作用来激活c-myc癌基因参与细胞转化和肿瘤发生。
【图文】：

星形细胞肿瘤,高级别,蛋白表达,相对含量

RT-PCR 法检测 DEK mRNA 的表达变化。（M：分子量标志；1~5 高级别星形细胞肿瘤组织；6~10 低级别星形细胞肿瘤组织；11~13 正常脑组织）3.2 Western blot 检测 DEK 蛋白的表达水平在正常脑组织中未检测到 DEK蛋白表达，全部星形细胞肿瘤组织中均有 DEK蛋白表达，其表达强度随星形细胞肿瘤级别增加而增加，，低级别星形细胞肿瘤组织 DEK 蛋白的相对含量(DEK IDV/β-actin IDV)为 0.55±0.11，高级别星形细胞肿瘤为 0.85 ±0.07，差异具有统计学意义(P<0.05)（见表 1.2，图 1.2）。表 1.2，DEK 蛋白在正常脑组织和星形细胞肿瘤组织中的表达总例数（n）阳性例数（n）DEK 相对含量DEK IDV/β-actin IDV

星形细胞肿瘤,蛋白,高级别,星形细胞

Western blot 法检测 DEK 蛋白的表达。（1~5 高级别星形细胞肿瘤组织；6~10 低级别星形细胞肿瘤组织；11~13 正常脑组织）3.3 免疫组织化学染色法检测 DEK 蛋白在各组组织中的分布和表达DEK 蛋白主要定位于星形细胞的细胞核内， 32 例星形细胞肿瘤组织中 31 例DEK 蛋白阳性，阳性表达率为 96.88%，5 例正常脑组织中 2 例为弱阳性表达，阳性表达率为 40.00%；DEK 蛋白阳性细胞百分率分别为：正常脑组织 35.96±5.70%，低级别星形细胞肿瘤组织 51.59±9.66%，高级别星形细胞肿瘤组织 88.31±5.58%，组间表达差异均具有显著性意义 (P<0.05)（具体结果见表 1.3~1.4，图 1.3~1.6）。表 1.3，免疫组化检测 DEK 蛋白在正常脑组织和星形细胞肿瘤组织中的表达组织例数表达强度（n）阳性率阳性细胞
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.2

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