新型多肽—阿霉素-miR-脂质体肝癌靶向治疗及抗耐药性效应
发布时间：2020-05-04 16:57
【摘要】：背景与目的:肝癌(HCC)是世界上第六大恶性肿瘤,其死亡率较高。在我国部分偏远地区特别是南方沿海地区的农村中占第二位,仅次于胃癌。肝硬化是HCC发生的基础,HCC患者每年新增病例、全球发病率不断增加。目前HCC的临床治疗面临巨大瓶颈问题:绝大多数患者丧失了手术治疗时机,而且,不管作为手术后化疗、以及非手术病人的保守治疗,都必须以化疗作为主要的、唯一的临床治疗措施。但是,目前临床化疗药物由于以下两点而呈现疗效不佳、毒性巨大、多药抗药性(MDR)建立迅速的巨大瓶颈。造成这种问题的根本原因主要也有两条:一是大多数药物没有癌细胞/组织靶向性,或者靶向性不足;二是这些药物不能有效地抑制MDR的形成。以上原因造成目前药物治疗效果较差、毒性巨大的临床化疗特征,特别是HCC这样高度恶性的肿瘤患者临床治愈率(即临床标准的生存期)低下和短期死亡率的居高不下!根据以上所述,如何提高目前临床抗癌一线化疗药物的靶向性和抗MDR特性是癌症特别是HCC未来新一代化疗药物发展的有效途径和希望。阿霉素(Doxorubicin,DOX)是目前临床常用的作用于DNA的一线广谱抗肿瘤药,该药由于具有强大的癌细胞杀伤能力被认为是最有效的HCC化疗药物之一,但是,DOX巨大的毒性特别是心脏以及其他增殖性细胞的毒性十分突出。后来研发并上市了数种品牌的DOX脂质体(Lipo-DOX),该药由于易于与细胞膜融合而大大提高了 DOX在细胞内的浓度,从而明显增强了 DOX对癌细胞的杀伤效率。但是,由于该药没有明显的靶向性而使其毒性仍然很强烈,也会很快建立MDR。因此,解决靶向性、MDR逆转问题是包括Lipo-DOX在内的化疗药物亟待解决的问题,也是目前癌症临床取得突破性进展的有效途径之一。基于上述靶向性、MDR逆转问题,设计了如下药物载体体系并完成了其体外药效的部分实验。我们前期筛选得到了 HCC靶向性12肽HCSP4,并进行了一系列包括临床标本在内的体内外人HCC细胞/组织特异性和敏感性验证,结果显示HCSP4对HCC具有非常良好的结合特异性和敏感性,所以,完全可以以HCSP4作为导向元件解决HCC靶向性问题!关于抗MDR也就是MDR逆转问题,结合文献和我们自己的数据库分析预测,认为一种miRNA(具体名称暂时不便公开)具有可以逆转化疗药物MDR的潜力,我们成功的以这种miRNA的前体(pre-miRNA)构建了其质粒表达载体。本研究以上述多肽、miRNA构建靶向HCC的具有MDR逆转特征的DOX脂质体载药体系(HCSP4-Lipo-miRNA-DOX),设想这种体系可能具有HCC高度的靶向性、明显的MDR逆转特征,从而达到DOX高效低毒、无或弱MDR的HCC治疗效果!这种设计本身具有很高的理论基础和原创性,也非常符合目前世界范围内癌症临床的实际需要。对制备的HCSP4-Lipo-miRNA-DOX通过粒径、分散系数、药物包封率、靶向性检测等进行脂质体特性研究,结果显示达到了预期要求的特性范围。为了研究HCSP4-Lipo-miRNA-DOX对HCC的治疗效应,并评估其DOX的MDR逆转能力,本研究在HCSP4-Lipo-miRNA-DOX转染细胞后,研究该脂质体载药体系对人HCC细胞HepG2和DOX耐受性人HCC细胞HepG2/ADR的细胞毒性、增殖力、运动力、凋亡的生物学效应,特别以HepG2/ADR的上述检测结果来评估其对HCC细胞DOX的MDR逆转效应。方法:1.以mirbase(http://www.mirbase.org)在线确定目标miRNA的前体序列,设计插入片段,通过合成、退火,将其插入pcDNA6.2-GW载体中,得到pcDNA6.2-GW/miRNA。2.以薄膜超声分散法制备HCSP4修饰的脂质体,用硫酸铵pH梯度法装载DOX药物,利用阳离子脂质体与负电荷质粒相互作用的性质连接miRNA,得到一种新型HCSP4靶向的miRNA阿霉素脂质体,HCSP4-Lipo-miRNA-DOX。3.应用激光粒度仪、透射电子显微镜、扫描电子显微镜、荧光分光光度计等技术检测新型脂质体HCSP4-Lipo-miRNA-DOX的药物包封率高及其他脂质体特性。4.将 pcDNA6.2-GW/EmGFP 质粒代替 pcDNA6.2-GW/miRNA 对HCSP4-Lipo-miRNA-DOX体系的转染效率进行优化,通过转染人胃癌SGC7901和人肝癌HepG2对HCSP4靶向性进行评估。5.将 HCSP4-Lipo-miRNA-DOX 转入 HepG2 和 HepG2/ADR,以野生细胞和HCSP4-Lipo-DOX作为对照,应用MTT法、损伤修复法、流式细胞仪、细胞和核染色等技术检测HCSP4-Lipo-miRNA-DOX对HepG2和HepG2/ADR的细胞杀伤力、增殖、运动、凋亡的影响。6.对于该miRNA可能靶向的若干与MDR形成相关的基因表达进行了检测,实验取得巨大成功,获得了 HCSP4-Lipo-miRNA-DOX逆转MDR的初步的分子机理!该部分结果、内容将在师妹继续本研究后续研究的资料内陈述,本论文不包括该部分内容陈述。结果:1.成功构建了目标miRNA表达质粒,测序正确。2.成功制备了 HCSP4-Lipo-miRNA-DOX体系,检测其DOX药物包封率高(90%)、脂质体形状呈球形,大小均一,分布均匀,粒径是± 130nm,符合未来体内应用要求。3.HCSP4-Lipo-miRNA-DOX 体系转染 HepG2 细胞,转染效率80%,HCSP4 导向的脂质体靶向性良好。4.MTT、损伤修复法、DAPI染色、考马斯亮蓝染色、细胞平板克隆、流式细胞仪结果提示HCSP4-Lipo-miRNA-DOX脂质体本身为较安全的生物材料,其对HepG2和HepG2/ADR细胞的杀伤力明显增强,明显强化了 DOX抑制细胞的增殖、迁移能力,促进了 DOX促使HCC细胞的凋亡过程,并将细胞周期阻滞于G1期。结论:初步实验结果表明HCSP4-Lipo-miRNA-DOX脂质体载药体系是一种新型的HCC特异的治疗药物靶向递送载体体系,HCSP4-Lipo-miRNA-DOX对HepG2细胞的杀伤力强于HCSP4-Lipo-DOX,对HepG2/ADR细胞的杀伤力显著强于HCSP4-Lipo-DOX。根据上述实验结果,HCSP4-Lipo-miRNA-DOX具有良好的HCC体外治疗效应,更重要的是具有HCC治疗过程中DOX的MDR形成的显著抑制作用,使DOX药物能持续发挥其杀伤效果,这对于提高DOX临床对HCC的治疗效应、降低毒性、抑制HCC治疗后复发率等,都具有十分重要的意义和诱人社会经济效益!HCSP4-Lipo-miRNA-DOX的设计具有世界范围内的原创性,我们的上述初步研究结果提示其对HCC的治疗具有重要价值,值得我们后续继续强化研究。同时,本实验设计和结果对于其他癌症种类及化疗药物的改造研发都具有重要的借鉴意义。
【图文】：
ＨＣＣ的发生是一个多级步骤的过程，预示着在细胞分化和增殖过程中存在异逡逑常，并且持续存在一个异常的血管生成。调g⑾郑罚埃梗埃サ模龋茫貌』颊叽嬖诼义闲愿尾 ⒏斡不恼锒媳尘埃芤ⅲ龋茫玫奈Ｏ找蛩兀ㄍ迹保保┌ㄒ韵录父龇藉义厦妫魄苟舅兀粒疲拢薄⒁腋尾《荆ǎ龋拢郑⒈尾《荆ǎ龋茫郑⒕凭愿尾 ⒋义闲晃陕摇⒎逝趾头蔷凭灾拘愿窝椎穆愿腥镜取Ｒ恍┮糯湟煊肴死啵龋茫糜绣义瞎兀ǔ；蚋谋涞贾氯旧澹模危恋牡檬В谀承┤旧迩虻任换蚨у义希ǎ蹋希龋郏罚荩职┗蚝椭掳┗蛲槐洹２煌∫蛞⒌模龋茫弥校Ｊ芗父鐾揪队板义舷欤ǎ遥拢蓖揪丁ⅲ穑担场荆福萃揪兑约埃祝睿敉揪兜取＃龋茫靡种苹颍穑担车耐槐洌阱义辖玻埃サ模龋茫没疾≌咧械玫街な担庵滞槐湓诓煌乩砦恢玫闹琢鲋型槐渌俣儒义希卞义
本文编号：2648707
【图文】：
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