miR-21通过PTEN介导细胞自噬对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响

发布时间：2020-05-04 16:58

【摘要】：目的:研究miR-21通过调控PTEN对自噬的影响。进一步探讨miR-21调节的自噬对膀胱癌细胞凋亡、增殖的作用及可能的机制。为剖析miR-21对细胞自噬以及膀胱癌的影响奠定基础。方法:1.miR-21通过调控PTEN对自噬的影响。培养人膀胱T24细胞,并构建以质粒为载体转染的miR-21基因沉默T24细胞(m i R-21 inhibitor组)、mir-21基因过表达T24细胞(miR-21 mimics组)为实验组,以质粒空载体转染的T24细胞(miR-21 mimics-NC、miR-21 inhibitor-NC)为阴性对照组以及另外两组未转染T24细胞(Blank control)为空白对照组,转染48h后,采用miRNA Realtime、RT-PCR和Western Blot分别从m RNA和蛋白水平检测各组细胞的miR-21、PTEN和自噬相关蛋白beclin 1、LC3-II,探讨miR-21通过PTEN调节自噬发挥作用的可能机制。2.研究miR-21通过PTEN介导细胞自噬对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响甲基偶氮唑蓝(MTT)法查看各组T24细胞的增殖变化情况。流式细胞术(FCM)检测分析细胞凋亡率和细胞周期;并用RT-PCR和Western Blot检测各组细胞周期蛋白cyclin D1和细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平,观察miR-21通过PTEN介导不同细胞自噬水平对细胞增殖凋亡的影响。结果:1.miR-21通过调控PTEN对膀胱癌T24细胞自噬的影响本研究结果表明在干预4h后与阴性对照、空白对照组相比较,miR-21-mimic干预的T24细胞miR-21 m RNA明显增加而PTEN和LC3-Ⅱ、beclin 1 m RNA和蛋白表达水平明显降低,差异均具有有统计学意义(P0.05);同时与对照组相比较,miR-21-inhibitor干预的T24细胞miR-21 m RNA明显降低而PTEN和LC3-Ⅱ、becli 1 m RNA和蛋白表达水平明显增加,差异有统计学意义(P均0.05)。2.研究miR-21通过PTEN介导细胞自噬对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响运用MTT法对不同时间节点(0h、24h和48h)的膀胱癌T24细胞活性进行测定,发现与对照组对比,予miR-21-mimic干预的T24细胞活性呈现对时间的依赖性增长,差异均有统计学意义(P均0.05)。与对照组相对比,予miR-21-i nhibitor干预的T24细胞活性呈现对时间依赖性下降,差异有显著统计学意义(P均0.05)。同时miR-21-mimic干预的T24细胞中cyclin D1表达量上升,说明促进细胞增殖。其次我们用流式细胞仪观察到,与空白对照组和miR-21-mimic组比较,miR-21-inhibitor组凋亡率显著升高(P0.01),同时Caspase-3表达量上升,说明Caspase-3被激活,细胞凋亡被诱导。此外通过FCM检测各组细胞周期,发现与空白对照Blank control和阴性对照miR-21 mimics-NC相比,miR-21 mimics组的G1期细胞增多,G2期的细胞显著减少(**P0.01),提示细胞发生了G1期阻滞,说明上调miR-21使细胞周期阻滞在G1期。同样的下调miR-21使细胞发生了G2期阻滞。结论:1)miR-21在膀胱癌细胞中可能通过调控PTEN的表达,调节细胞自噬。2)miR-21通过PTEN介导的细胞自噬,对膀胱癌细胞呈现促进增殖抑制凋亡的表现。
【图文】：

转染效率

第四章实验结果第四章实验结果4.1 miR-21 mimics 和 inhibitor 瞬时转染膀胱癌 T24 细胞后荧光表达情况于荧光显微镜下观察各组膀胱癌 T24 细胞，转染 48h 后荧光表达情况,阴性对照组 miR-21 mimics-NC、阴性对照组 miR-21 inhibitor-NC 及 miR-21 mimics、miR-21inhibitor 组均可见大量绿色荧光，表明目的质粒已成功转入 T24 细胞内，可检测各组 T24 细胞中的 miR-21 表达情况。转染效率检测：

转染效率,转染

图 2 miR-21 inhibitor-NC、miR-21 inhibitor 转染效率检测(10×20)FIG. 2 mir-21 inhibitor-NC and mir-21 inhibitor transfection efficiency detection(10×20).4.2 miRNA Realtime 实验检测结果4.2.1 实验分组NO：样本 NO：样本1 A，Blank control 4 A，Blank control2 B，miR-21 mimics-NC 5 B，miR-21 inhibitor-NC3 C，，miR-21 mimics 6 C，miR-21 inhibitor4.2.2 转染后各组膀胱癌 T24 细胞中 miR-21 的表达转染上调组（miR-21 mimics）及阴性对照组（miR-21 mimics-NC）、空白对照组（Blank control）miR-21 相对表达量分别为 1.0219±0.0365、1.0629±0.0479、2.0699±0.1011。上调组 mi R-21 表达水平则明显高于空白对照组和阴性对照组
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14

【参考文献】