液质联用（HPLC-MS）技术筛查CypA及其单克隆抗体在结直肠癌诊断中的评价

发布时间：2020-05-04 21:14

【摘要】：结直肠癌又称为大肠癌(colorectal cancer,CRC),是全世界第三大常见癌症。2014年美国新增CRC病例和CRC死亡的估计数分别约为135,000和50,000。早期诊断是结直肠癌最重要的预后影响因素,对于没有局部或远处转移的早期疾病,5年存活率约为90%,但当存在远处转移时,存活率仅为10%。自20世纪80年代中期以来,与许多其他西方国家相比我国的结直肠癌发病率有所下降,尤其是晚期疾病。尽管造成这种下降的原因尚不清楚,但CRC筛查的推广可能是一个重要因素。结直肠癌家族史,炎症性肠病和罕见遗传病例如家族性腺瘤性息肉病和Lynch综合征使得个体患CRC的风险增加。但是在没有任何这些已知风险因素的所谓平均风险人群中CRC发病率逐年增高。在一般人群中,年龄是CRC最重要的危险因素,90%以上的病例发生于50岁以上的个体。流行病学研究表明,生活方式的因素可能会影响CRC的发病风险,与风险增加有关的因素包括红肉和加工肉类的高摄入量,吸烟,过度饮酒和肥胖,而体力活动和使用阿司匹林与CRC风险降低有关。由于缺乏CRC预防的明确方式,筛查是目前降低CRC负担最广泛也最易接受的方法。近年来,诸多研究者应用蛋白质组学等分子生物学技术针对结直肠癌的肿瘤标志物进行了研究,目前已知的相关的分子标志物例如:KRAS(抗EGFR抗体治疗的预测标记物)、B-Raf V600E(抗EGFR抗体抗性的生物标志物)、PIK3CA、ERCC-1(奥沙利铂的可能预测标志物)、PTEN(CRC患者无进展生存期较短相关)、COX-2、Ezrin。蛋白质组学的广泛应用使得人们对肿瘤的了解逐步加深。本研究在收集了结直肠腺癌组织标本后,通过二维液相质谱色谱发分析结直肠腺癌组织及配对的癌旁组织,分析质谱数据,建立差异表达蛋白质谱,本研究选取Cyp A作为目的蛋白,通过基因扩增、载体构建以期诱导表达融合蛋白,制备Cyp A单克隆抗体,并对抗体进行纯化,鉴定;免疫组化验证Cyp A在组织中的差异表达并分析Cyp A的表达与相关的病例参数之间的关系。本研究共分为四部分:第一部分结直肠癌与癌旁组织的差异蛋白质组学研究实验方法:1.选择20例确诊为TNMIII期腺癌且并未进行治疗的患的病变部位的癌组织样本,及其附近10cm之外的癌旁组织。2.提取标本总蛋白,测定蛋白质浓度。3.制备蛋白水解多肽混合物。4.二维液相色谱法分离样本。5.通过LTQ XL离子阱质谱仪对二维色谱洗脱的多肽进行检测。6.对质谱数据进行生物信息学分析,找到癌组织与癌旁组织差异表达的蛋白质。结果:1、经分析,肿瘤组织中获得了蛋白点357个;癌旁组织中蛋白质点获得了243个。经比对,检索,两种组织中差异表达的蛋白质30个。2、上调表达蛋白(20个):Cyp A、ATP5B、TPM4、FGA、GSTP1、HIST1H3J、IGHA1、SERPINH1、TUBB3、IGHA1、TPM3、CKAP4、IGHA2、POSTN、FGB、FGG、PKM2、HIST1H2AE、MYH10和TUBB。3、下调表达蛋白(10个):SYNM、MYH11、PKM2、KRT10、FLNC、H2AFX、CAP1、MYL6、TUBB2A、TLN1。4、从差异表达蛋白谱中选取Cyp A为目标蛋白展开后续的研究。第二部分:Cyp A基因扩增、载体构建及诱导表达融合蛋白实验方法:1.基于Gen Bank-nucleotide数据库里面的Cyp A基因序列,完成Cyp A基因的扩增。2.连接Cyp A目的基因与p ET28a,构建原核表达载体,使BL21细胞发生转变,由此获取表达菌株BL21(7)DE3(8)(7)p ET28a/Cyp A(8)并诱导其表达。3.通过超声让菌体破碎,镍琼脂糖亲和层析纯化目的蛋白。4.SDS-PAGE检测纯化蛋白。5.Western bloting分析融合蛋白。实验结果:1.顺利创建p ET28a/Cyp A(原核表达质粒),经DNA测序,Gen Banknucleotide比对,明确其为目的序列。2.完成转化、诱导表达、纯化,SDS-PAGE及Western bloting鉴定环节工作后,得到纯化目的蛋白。第三部分Cyp A单克隆抗体制备、纯化、鉴定实验方法:1.制备Cyp A蛋白免疫原,皮下注射免疫小鼠。取免疫小鼠脾脏,制备细胞,与骨髓瘤细胞融合。2.HAT选择性培养,ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株;3.阳性杂交瘤细胞株腹水制备及腹水抗体效价检测;4.亲和层析法纯化腹水中单克隆抗体;5.SDS-PAGE分析纯化的单克隆抗体,常染色体染色分析杂交瘤细胞核型。实验结果:1.得到1株稳定分泌抗人Cyp A单克隆抗体的杂交瘤细胞株;2.抗体效价达1:160000,抗体纯度达95%以上。第四部分Cyp A在组织中的差异表达及临床病理参数分析实验方法:1.收集30对结直肠癌组织及癌旁组织;2.根据病理诊断TNM分期将临床病理资料分组;3.免疫组化法检测Cyp A在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达,并分析Cyp A表达与结直肠癌患者临床参数的相关性。实验结果:1.通过免疫组化观察到结直肠癌组织和癌旁组织中均可检测到Cyp A阳性表达,结直肠癌组织中表达率水平显著高于癌旁组织。2.Cyp A蛋白阳性表达率与结直肠癌的肿瘤分化水平及淋巴结转移有关:在肿瘤伴淋巴结转移的肿瘤组织中Cyp A蛋白阳性表达率较高。通过以上研究,我们得出以下结论:1.本研究成功建立了结直肠癌组织与癌旁组织的差异蛋白谱。2.成功建立了Cyp A蛋白的杂交瘤细胞株,并进行了纯化与鉴定;同时制备了Cyp A蛋白的单克隆抗体,从而为后续的研究做好充分的准备工作。3.验证了结直肠癌组织中Cyp A的表达量显著高于癌旁组织。4.分析了Cyp A蛋白与肿瘤淋巴结转移、TNM分期的关系,为判断结直肠癌疾病的发展提供了潜在的依据。
【图文】：

串联质谱,序列

CYPA蛋白的质谱鉴定:AGPNTNGSQFFIC}CAM}TAK序列肤段的串联质谱图

串联质谱,序列

CYPA蛋白的质谱鉴定:EGMNIVEAMER序列肤段的串联质谱图
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

【参考文献】