中期因子对甲状腺癌转移预测的临床价值及靶点治疗实验研究

发布时间：2020-05-04 23:48

【摘要】：目的:血清中期因子(midkine,MK)在多种恶性肿瘤中呈高表达,对肿瘤的发生、发展等发挥重要生物学作用。有关MK在甲状腺癌中研究报道较少,本文旨在探讨MK对甲状腺乳头状癌转移的预测价值;抑制MK在未分化甲状腺癌细胞(ARO)中的表达,研究其对细胞凋亡、增殖的影响及相关机制。方法:(1)回顾性分析2011年1月至2015年1月在天津医科大学总医院核医学科接受~(131)I治疗的并且至少随访2年的241例术后甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)患者。通过酶联免疫吸附法测定PTC患者首次~(131)I治疗前及其后10-12个月时血清MK浓度,根据首次~(131)I治疗后10-12个月时血清MK及促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)刺激状态下甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)浓度与首次~(131)I治疗时比较将PTC患者分为3组,统计分析血清MK及Tg对PTC患者转移风险的预测价值;(2)通过蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测甲状腺癌及癌旁组织、甲状腺癌细胞系(FRO、ARO、WRO、KTC及TPC)中的MK表达水平;将5种MK特异性siRNA采用脂质体转染法转染未分化型甲状腺癌(anaplastic thyroid cancer,ATC)细胞(ARO细胞),下调细胞中MK表达,同时检测MAPK和PI3K两条通路关键蛋白ERK1/2和Akt磷酸化水平及下游凋亡相关蛋白caspase-3和survivin的表达变化;设置不同浓度梯度MK-siRNA-3转染ARO细胞,通过细胞MTT试验观察MK下调对于细胞增殖的影响。结果:(1)241例患者在行首次~(131)I治疗之前至少1月,已行甲状腺全切或甲状腺次全切术和(或)颈部淋巴结清扫术,术后病理诊断证实为PTC且癌灶大小及淋巴结转移分区明确。首次~(131)I治疗后的10-12个月时TSH刺激状态下Tg降低(与首次~(131)I治疗前TSH刺激状态下Tg相比),但未达到理想Tg水平(TSH刺激状态下Tg低于1.0 ng/ml),PTC患者发生转移的风险是Tg降至理想水平的12.5倍(P0.01)。当Tg增加(与首次~(131)I治疗前TSH刺激状态下Tg相比),PTC患者发生转移的风险是Tg降至理想水平的19.5倍(P0.01)。首次~(131)I治疗后的10-12个月时血清MK水平下降(与首次~(131)I治疗前血清MK相比),但未达到普遍接受的正常水平(255.01±126.78 pg/ml),PTC患者发生转移的风险是血清MK降至普遍接受的正常水平(255.01±126.78 pg/ml)的3.0倍(P0.01)。当血清MK水平增加(与首次~(131)I治疗前血清MK相比),则发生转移风险是血清MK降至普遍接受的正常水平(255.01±126.78 pg/ml)的5.0倍(P0.01)。在第3组患者中,无病生存率显著低于其它任何两组。(2)Western blotting结果显示甲状腺癌组织及癌旁正常组织中均见MK表达,且MK在甲状腺癌组织中表达明显高于癌旁组织(5.51倍);在甲状腺癌5个细胞系(FRO、ARO、WRO、KTC及TPC)中,甲状腺癌细胞系ARO、WRO、KTC中MK呈高表达,且MK在ARO中的表达高于WRO及KTC,而甲状腺癌细胞系FRO及TPC中未见明显MK表达。针对MK的5种特异性siRNA(工作浓度为50nM)作用于ARO细胞48小时后,均能有效抑制ARO细胞中MK的表达;siRNA转染ARO细胞72小时后,siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4均可抑制PI3K通路中Akt的磷酸化水平,并下调下游抗凋亡蛋白Survivin、上调促凋亡蛋白Caspase-3水平,差异有统计学意义(p0.05);对于MAPK通路,只有siRNA-4处理组抑制Erk1/2磷酸化水平(p0.05)。siRNA-3转染ARO细胞作用24小时后细胞存活实验显示,在MK-siRNA-3浓度高于500nM时,具有抑制甲状腺癌细胞增殖的作用。结论:监测血清MK动态变化对PTC患者发生转移风险的预测具有潜在的临床价值。MK在甲状腺癌中高表达,通过抑制MK的表达,可影响MAPK及PI3K通路的磷酸化及凋亡相关蛋白水平,并可抑制细胞增殖。
【图文】：

表达差异,甲状腺,正常组织,甲状腺癌

2.5.2 甲状腺癌细胞系中 MK 的表达情况在甲状腺癌 5 个细胞系中检测 MK 表达情况，其中，MK 在 ARO、WRO、KTC 中高表达，且在 ARO 中表达最明显，而在 TPC 及 FRO 中未见明显表达。（见图 3）以下实验均以 ARO 细胞为研究对象。2.5.3 siRNA 对 ARO 细胞 MK 表达沉默的效果

细胞增殖,转染,处理组,凋亡相关蛋白

392.5.7 siRNA 沉默 MK 后对凋亡相关蛋白的影响对于转染 siRNA 作用 72 小时后的 ARO 细胞，，MK 表达水平降低，与对照组比较，在 siRNA-1、siRNA-2 处理组抗凋亡蛋白 Survivin 明显下降（p<0.01）；siRNA-3、siRNA-4 处理组抗凋亡蛋白 Survivin 下降（p<0.05）；而抗凋亡蛋白Survivin 在 siRNA-5 处理组未见明显变化（p>0.05）。促凋亡蛋白 Caspase-3 在siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 处理组呈明显下降趋势（p<0.01），在 siRNA-4 处理组下降（p<0.05），在 siRNA-5 处理组未见明显变化（p>0.05）（见图 8、图 9）
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R736.1

【参考文献】