槐耳对乳腺癌阿霉素耐药的影响及作用机制研究

发布时间：2020-05-06 20:49

【摘要】：研究目的:乳腺癌是全世界范围内女性发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。近年来在中国,乳腺癌的发病率以每年3%的增长速度增加[2,3]。截止到2014年,中国新发乳腺癌患者占全球新发乳腺癌患者的12.2%,乳腺癌病死数达到了全球总数的9.6%[3,4]。化学疗法,简称化疗,作为极为重要的乳腺癌临床治疗方式,能够显著延长乳腺癌患者的无病生存期及总生存期,提高患者术后生活质量,在临床中应用极为广泛,造福了广大乳腺癌患者。然而,由于乳腺癌细胞对化疗药物(如阿霉素)产生耐药性常常导致化疗失败,威胁乳腺癌患者的生存。因此,研发出能够抑制化疗耐药的辅助性治疗药物成为解决目前这一窘境的重要方式。为减少多重耐药的产生,基础研究以及临床工作中通常采用不同药物配伍使用的方式。近年来,联合应用中药治疗乳腺癌越来越受到瞩目[5]。许多研究表明,化疗联合中药可降低化疗引起的副反应,从而改善乳腺癌患者预后并提高生活质量。槐耳作为传统中药已有1,600年之久,近几十年来,因其有效的抗癌作用已被常规用作乳腺癌的辅助治疗药物。但其对乳腺癌化疗耐药的作用尚不明确。本研究通过分子生物学基础研究,探讨槐耳对乳腺癌阿霉素耐药的影响及其作用机制,为乳腺癌患者临床用药提供重要的理论依据。研究方法及结果:在本课题中,我们对槐耳抑制乳腺癌阿霉素耐药的机制进行了全面深入的研究,具体研究内容主要包括以下四部分:第一部分乳腺癌阿霉素耐药细胞株的建立及槐耳抑制阿霉素耐药研究方法:经过长达8个月时间的研究及培育,我们团队在体外应用阿霉素(0.01uM~0.1mM)逐步加压诱导筛选MDA-MB-231细胞,最终培养出耐阿霉素的耐药细胞株(231/Dox)。乳腺癌阿霉素耐药细胞的耐药表型利用含50ng/ml阿霉素的DMEM培养基加压培养加以维持。通过MTT实验分别检测乳腺癌阿霉素耐药细胞系(231/Dox)及亲代MDA-MB-231乳腺癌细胞系对阿霉素的敏感性,以验证阿霉素耐药细胞系是否成功建立及槐耳对乳腺癌阿霉素耐药乳腺癌细胞耐药性的影响。研究结果:MTT实验结果显示,乳腺癌阿霉素耐药乳腺癌细胞相较于亲代MDA-MB-231乳腺癌细胞,其对阿霉素杀伤作用的敏感性降低,表现为耐药细胞的IC50数值的增加,是非耐药细胞IC50值的3.27倍。MTT实验检测结果提示槐耳可抑制乳腺癌阿霉素耐药细胞系231/Dox的生长,并可显著增加阿霉素耐药细胞系对阿霉素的敏感性。第二部分槐耳可促进乳腺癌阿霉素耐药细胞的凋亡研究方法:为深入研究槐耳抑制阿霉素耐药乳腺癌细胞耐药性的分子生物学机制,我们利用流式细胞学技术及TUNEL实验技术检测槐耳对阿霉素耐药细胞系231/Dox细胞凋亡的影响;并通过蛋白质免疫印迹法检测槐耳对凋亡通路相关蛋白表达水平及活化状态的影响。研究结果:流式细胞学技术及TUNNEL检测技术检测结果显示槐耳可增强阿霉素诱导的阿霉素耐药细胞的凋亡;蛋白质免疫印迹实验显示槐耳处理可调节细胞凋亡通路相关凋亡蛋白的表达,从而促进阿霉素耐药乳腺癌细胞发生细胞凋亡。这些研究结果表明槐耳可促进乳腺癌阿霉素耐药细胞的凋亡,从而抑制乳腺癌阿霉素耐药。第三部分槐耳可抑制阿霉素耐药细胞的药物外排功能研究方法:我们利用钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein-AM)标记耐阿霉素乳腺癌细胞,检测槐耳是否对阿霉素耐药乳腺癌细胞(231/Dox)药物外排功能产生的影响,并利用荧光检测仪测量细胞内的荧光强度。同时利用蛋白质免疫印迹法检测P-gP蛋白在阿霉素耐药细胞(231/Dox)及亲代MDA-MB-231细胞内的表达水平差异,并观察槐耳是否能够影响P-gP蛋白的表达。研究结果:荧光定量检测结果显示,槐耳短时间(30分钟)处理乳腺癌阿霉素耐药细胞并不能增加细胞内的荧光强度;但耐药细胞经过长时间(24小时)的槐耳处理后,细胞内的荧光强度可显著增加。蛋白质免疫印迹实验结果表明,与亲代MDA-MB-231细胞相比,P-gP蛋白在阿霉素耐药细胞系乳腺癌阿霉素耐药乳腺癌细胞231/Dox中表达量显著升高;耐药细胞经过槐耳处理后,P-gP蛋白的表达水平随着槐耳浓度的增加及处理时间的延长而明显下降。第四部分槐耳靶向AKT信号通路抑制乳腺癌阿霉素耐药研究方法:通过AKT过表达载体构建、质粒转染、MTT实验检测AKT及AKT信号通路在阿霉素耐药、细胞凋亡及P-gP表达中的作用;并通过上述实验检测槐耳是否能够影响AKT及AKT信号通路。利用细胞转染及蛋白质免疫印迹实验观察槐耳是否靶向作用于AKT及AKT/mTOR信号通路促进阿霉素耐药细胞的凋亡并抑制P-gP蛋白表达量,从而抑制乳腺癌阿霉素耐药。研究结果:过表达AKT可降低乳腺癌阿霉素耐药细胞对阿霉素的敏感性,而槐耳则可逆转AKT过表达所导致的阿霉素耐药性的增加;进一步的蛋白质免疫印迹实验发现AKT的过表达可调节凋亡通路相关蛋白的表达,抑制细胞凋亡;并且过表达AKT还可上调P-gP转运蛋白的表达水平,从而增强细胞的药物外排功能;与此同时,槐耳则可通过抑制AKT的表达水平,相应地活化凋亡通路,并下调P-gP转运蛋白的表达量。结论:1.槐耳抑制乳腺癌阿霉素耐药细胞的耐药性。2.槐耳促进乳腺癌阿霉素耐药细胞的凋亡;3.槐耳下调耐药细胞P-gP转运蛋白的表达并抑制乳腺癌阿霉素耐药细胞的药物外排功能;4.槐耳通过靶向作用于AKT信号通路逆转乳腺癌阿霉素耐药。意义:1、阐明了槐耳对乳腺癌阿霉素耐药的抑制作用及其作用机制;2、证实了槐耳是乳腺癌化学疗法的有效增敏剂,并能一定程度上抑制阿霉素耐药,为乳腺癌临床辅助治疗提供理论依据。
【图文】：

实验测定,细胞,细胞活力,阿霉素

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技术检测,乳腺癌,细胞凋亡,实验检测

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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

【参考文献】