生物活性肽P11对人甲状腺癌的抑制作用及其分子机制

发布时间：2020-05-07 17:23

【摘要】：背景甲状腺癌(thyroid cancer,TC)是最常见的一种内分泌系统恶性肿瘤。虽然甲状腺癌在任何年龄都可发生,但是发病人群以中青年女性居多。甲状腺癌虽然占总的恶性肿瘤的比例较低,但是近些年来其发病率逐渐上升。从一些研究报告中可以得出,甲状腺癌在美国女性常见的恶性肿瘤的排名已经上升至第五位。随着我国经济社会的发展,甲状腺癌已经逐渐上升为恶性肿瘤疾病中的第七位,社会各界对甲状腺癌的关注逐渐提高。因此,积极进行预防和治疗甲状腺癌具有重要意义和科学价值。生物活性肽因其理化性质及其较高的生物活性又被称为功能肽。含有10个以上但不超过50个氨基酸残基的被总称为多肽。研究发现生物活性肽对机体的生命活动非常重要,生物活性肽的应用非常广泛,目前主要用于保健品以及调整免疫功能等方面。目前通过噬菌体展示文库技术已经鉴定出许多抗肿瘤的多肽,其中包括两条肽,即CYYGQSKYC(P6)和LSPPRYP(P9)。P6肽可以通过阻断血管生长因子C与其受体血管内皮生长因子受体3结合,从而能够抑制肿瘤细胞迁移与侵袭。P9肽能够阻断碱性纤维母细胞生长因子与纤维母细胞生长因子受体结合,从而抑制黑色素瘤生长。本课题将P6肽与P9肽通过柔性连接子Gly-Gly-Gly(GGG)连接起来,形成一条新型多肽CYYGQSKYCGGGLSPPRYP,即P11肽。本课题采用生物活性肽P11进行体外实验:细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及信号通路检测和体内实验:建立裸鼠移植瘤模型、检测血管新生等来研究生物活性肽P11对人甲状腺癌细胞生长的作用机制。目的研究生物活性P11肽对人甲状腺癌细胞生长作用及其分子机制。方法1、体外实验1.1 MTS实验进行MTS实验,对人甲状腺癌细胞系TT、ARO和TPC-1细胞给予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS为Control组)处理24 h后,在酶标仪上准确测量各组的OD值,检测各组甲状腺癌细胞的活力。1.2 EDU实验进行EDU实验,对人甲状腺癌细胞系TT、ARO和TPC-1细胞给予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS为Control组)处理24 h后,通过与Apollo567荧光染料发生特异性反应,在倒置荧光显微镜下避光拍摄肿瘤细胞,用来检测各组肿瘤细胞增殖情况。细胞增殖率=(EdU阳性细胞)/(总细胞数)×100%。1.3细胞迁移及侵袭实验进行细胞划痕、迁移以及侵袭实验,对人甲状腺癌细胞TT、ARO和TPC-1细胞给予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS为Control组)处理24 h,分别在0 h、12 h以及24 h对细胞进行拍照,通过分析细胞划痕的愈合情况以及穿透的细胞数来检测各组人甲状腺癌细胞的迁移以及侵袭能力。1.4 Western Blot检测对人甲状腺癌细胞TT、ARO和TPC-1细胞给予200μmol/L P6肽、P9肽、P6+P9肽和P11肽(以PBS为Control组)处理24 h,提取甲状腺癌细胞蛋白,检测各组甲状腺癌细胞中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、8、9和Cleaved PARP以及PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、m-TOR和p-mTOR的表达水平,以β-actin为参照。2、体内实验2.1建立裸鼠移植瘤模型建立肿瘤模型:将人甲状腺癌细胞TT、ARO和TPC-1细胞按照5×10~6个细胞量在每只裸鼠右侧腋下进行无菌注射,24 h后观察成瘤情况,接种肿瘤成功率达100%。2.2肿瘤抑制率测定实验分组以及给药情况:接种后24 h,分别将接种人甲状腺癌TT、ARO和TPC-1细胞的裸鼠按体重随机分5组,每组6只:阴性对照组(生理盐水)、P6肽组(320μg/kg/d)、P9肽组(320μg/kg/d)、P6肽+P9肽组(320μg/kg/d)、P11肽组(320μg/kg/d)。各组均采用瘤旁注射,按照0.1 mL/10 g的给药体积进行,连续进行4周,实验期间裸鼠自由饮食和饮水。每日测量裸鼠移植瘤的长(a)短(b),按照公式:V(volume)=ab~2/2计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线,裸鼠处死后,取出肿瘤并称重,按照公式:IR(inhibitory rate)=[(A-B)/A]×100%,A为对照组裸鼠体重,B为给药组裸鼠体重。2.3 HE染色肿瘤组织取出后,经10%甲醛固定,做常规石蜡包埋,连续切片。切片厚度5μm,HE染色,显微镜下观察病理组织学改变并拍照。2.4免疫组织化学染色将石蜡包埋肿瘤组织用CD31和Ki67抗体染色,然后孵育二抗,显微镜下观察肿瘤组织中CD31与Ki67的表达水平。结果1、MTS和EDU实验结果表明:与正常组、P6肽组、P9肽组、P6+P9肽组相比,生物活性肽P11显著降低了人甲状腺癌细胞TT、ARO和TPC-1增殖和存活率(P0.05)。2、细胞划痕、迁移以及侵袭实验结果表明:与正常组、P6肽组、P9肽组、P6+P9肽组相比,生物活性肽P11明显抑制人甲状腺癌细胞TT、ARO和TPC-1迁移以及侵袭的能力(P0.05)。3、采用Western Blot检测凋亡相关蛋白结果表明:与正常组、P6肽组、P9肽组、P6+P9肽组相比,生物活性肽P11明显提高人甲状腺癌细胞TT、ARO和TPC-1中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的表达水平(P0.05)。4、采用Western Blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白结果表明:与正常组、P6肽组、P9肽组、P6+P9肽组相比,生物活性肽P11明显降低人甲状腺癌细胞TT、ARO和TPC-1中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达水平(P0.05)。5、裸鼠移植瘤结果表明:与正常组、P6肽组、P9肽组、P6+P9肽组相比,生物活性肽P11明显抑制人甲状腺癌TT、ARO和TPC-1移植瘤生长(P0.05)。6、免疫组织化学结果表明:与正常组、P6肽组、P9肽组、P6+P9肽组相比,生物活性肽P11明显降低裸鼠移植瘤组织中CD31和Ki67的表达水平(P0.05)。结论1、生物活性肽P11能够抑制人甲状腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。2、生物活性肽P11通过阻断PI3K-AKT-mTOR信号通路从而促进人甲状腺癌细胞的凋亡。3、生物活性肽P11通过抑制肿瘤血管新生从而抑制人甲状腺癌生长。
【图文】：

甲状腺癌,生物活性肽,癌细胞,多肽

图 3.1 P11 肽对甲状腺癌细胞活性以及增殖能力的作用对人甲状腺癌细胞 TT、TPC-1 和 ARO 经过 200 μmol/L 不同多肽药物（P6、P9、P6+P9 和 P11肽）孵育 24 h 后，采用 MTS 和 EDU 实验检测各组多肽对人甲状腺癌细胞增殖的影响。(A) MTS 结果统计分析（n=3）；(B) EDU 染色图片（图片放大倍数为 100×）；(C) 对细胞增殖能力进行统计（n=6）。实验数据用平均值±标准误（Mean±SEM）表示，*P < 0.05，**P < 0.01 vs 对照组；△P < 0.05，△△P <0.01 vs P6 肽；▲P < 0.05，▲▲P < 0.01 vs P9 肽，#P < 0.05，##P < 0.01 vs P6+P9 肽。3.2 生物活性肽 P11 抑制人甲状腺癌细胞迁移和侵袭划痕实验以及Transwell被用来检测多肽对人甲状腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。与正常组（control）相比，人甲状腺癌细胞经过 P6 肽、P9 肽、P6+P9 肽和 P11 肽孵育24 h 后，能够抑制甲状腺癌细胞的迁移（P < 0.05），与 P6 肽、P9 肽、P6+P9 肽相比，P11 肽明显抑制了人甲状腺癌细胞的迁移和侵袭（P < 0.05）。生物活性肽 P11 对人甲状腺癌细胞 TT、TPC-1 和 ARO 迁移与侵袭作用见图 3.2。

细胞迁移,甲状腺癌,生物活性肽

图 3.2 P11 肽对人甲状腺癌细胞迁移与侵袭的作用对人甲状腺癌细胞 TT、TPC-1 和 ARO 经过 200 μmol/L 不同多肽药物（P6、P9、P6+P9 和 P11肽）孵育 24 h 后，采用划痕实验（A-B）、迁移以及侵袭实验（C-F）检测生物活性肽对人甲状腺癌细胞迁移以及侵袭的影响（图片放大倍数为 100×）。实验数据用平均值±标准误（Mean±SEM）表示（n=6）；*P < 0.05，**P < 0.01 vs 对照组；△P < 0.05，，△△P < 0.01 vs P6 肽；▲P < 0.05，▲▲P < 0.01 vsP9 肽，#P < 0.05，##P < 0.01 vs P6+P9 肽。3.3 生物活性肽 P11 促进人甲状腺癌细胞凋亡相关蛋白表达细胞凋亡是诱导肿瘤细胞死亡的一种重要途径，在凋亡的过程中，cleaved caspase-3、8、9、cleaved PARP是评定肿瘤细胞凋亡的重要因素。上述相关指标升高可以激活线粒体介导的凋亡通路，进而诱导肿瘤细胞凋亡。从结果可以看出，在人甲状腺癌细胞TT、TPC-1和ARO细胞中，与正常组相比，P9、P6+P9、P11肽组cleaved caspase-3、cleaved
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R736.1

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