C端截短HBX对HepG2细胞生物学活性的影响

发布时间：2020-05-08 09:40

【摘要】：目的构建表达C端截短HBX基因和蛋白的人肝癌HepG2细胞模型,并探讨其对HepG2细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。方法1.以肝癌组织中HBX常见的整合片段HBXΔ32(C端缺失32个氨基酸的HBX,全长369bp)、HBXΔ4(C端缺失4个氨基酸的HBX,全长453bp)和野生型HBX(全长465bp)为目的片段,分别构建腺病毒载体并转染HepG2细胞。以转染后的LV5-HBXΔ32、LV5-HBXΔ4、LV5-HBX细胞为实验组,LV5-NC(空病毒)和HepG2细胞为对照组探讨C端截短HBX对HepG2细胞生物学活性的影响。2.采用qPCR和WB的方法分别检测转染后的各组细胞HBX基因和蛋白的表达情况,判断转染是否成功。3.在培养基中加入CCK8,分别于1小时、2小时、3小时、4小时后检测并比较各组细胞OD值,探讨C端截短HBX对HepG2细胞增殖的影响。4.采用transwell实验检测转染后各组细胞的侵袭和迁移能力,探讨C端截短HBX对HepG2细胞侵袭和迁移的影响。5.采用流式细胞学技术检测转染后各组细胞凋亡的情况,探讨C端截短HBX对HepG2细胞凋亡的影响。结果1.本研究成功构建了表达C端截短HBX基因和蛋白的HepG2细胞,镜下可观察到GFP绿色荧光信号,经qPCR和WB验证有HBX mRNA和蛋白的表达。2.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各组细胞之间的增殖能力有差异,每个检测时间点其OD值差别有统计学意义(P值均0.05)。经两两比较发现,每个检测时间点HBXΔ32和HBXΔ4组细胞OD值均高于其他各组,且差异有统计学意义(P值均0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4组之间细胞的OD值差异无统计学意义(P0.05)。3.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各组发生侵袭的细胞数分别为277.89±20.64、266.78±22.09、163.44±21.02、157.78±22.02和160.56±21.51,各组间差异有统计学意义(P=0.000)。经两两比较发现,HBXΔ32和HBXΔ4组侵袭细胞数均高于其他各组,且差异有统计学意义(P值均0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4组之间侵袭细胞数差异无统计学意义(P=0.856)。4.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各组发生迁移的细胞数分别为95.22±16.84、94.44±12.99、66.56±9.50、71.00±8.79和69.78±9.71,各组之间迁移细胞数差异有统计学意义(P=0.000)。经两两比较发现,HBXΔ32和HBXΔ4组迁移细胞数均高于其他各组,且差异有统计学意义(P值均0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4组之间迁移细胞数差异无统计学意义(P=0.588)。5.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各组之间细胞凋亡率分别为1.43±0.522%、1.14±0.236%、1.06±0.033%、1.26±0.466%、1.24±0.653%,差异无统计学意义(P=0.505)。结论C端截短的HBXΔ32、HBXΔ4对人肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭、迁移能力有一定的促进作用,并未发现其对HepG2细胞的凋亡有影响。HBX C端的后4-32个氨基酸可能不是影响肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的主要功能域。本研究初步解释了C端截短的HBX基因的整合在广西肝癌高发区肝癌发病中所起的作用,为HBV相关性HCC的病因学探讨和综合防治提供了一定的实验依据和理论参考。
【图文】：

穿梭质粒,结构示意图,腺病毒

C 端截短 HBX 对 HepG2 细胞生物学活性的影响硕士学位结果1. 腺病毒结构和测序结果1.1 腺病毒结构该腺病毒由上海生工生物工程股份有限公司构建，，结构如图 3-1所示腺病毒的穿梭质粒为 LV5，该质粒包含表达绿色荧光蛋白的 GFP 基因以及呤霉素和氨苄青霉素抗性基因（后续筛选实验需要），启动子为 CMV 和 Eα ,酶切位点为 NotI/NsiI。

序列,测序,病毒,红色

C 端截短 HBX 对 HepG2 细胞生物学活性的影响硕士学位论文1.2 测序结果该腺病毒构建完成后由上海生工生物工程股份有限公司测序验证，测序结果如图 3-2、3-3、3-4 所示。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

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