HN-1多肽修饰的阿霉素纳米粒对口腔鳞癌移植瘤靶向性的初步研究

发布时间：2020-05-08 08:33

【摘要】：目的设计并制备HN-1多肽表面修饰的阿霉素(DOX)纳米粒HPD,初步研究其理化性质及对口腔鳞癌(OSCC)移植瘤的体内外靶向性。内容本论文研究的内容主要分为以下四部分:一、HN-1多肽在细胞水平对OSCC的靶向性考察。二、PD、HPD纳米粒的制备及其表征。三、HPD纳米粒的体外稳定性研究:HPD纳米粒的稳定性分析。四、HPD纳米粒的体内研究,HPD纳米粒在大鼠体内的药物代谢动力学行为考察、OSCC荷瘤小鼠模型的构建、HPD纳米粒在肿瘤组织以及正常器官的分布情况。方法1.HN-1多肽在细胞水平对OSCC的靶向性考察:将CAL-27、SCC-25、HepG2细胞分别与含FITC-HN-1、FITC-Ir(非靶向肽)的培养基共同培养,然后通过流式细胞术对多肽入胞率进行检测。2.PD、HPD纳米粒的制备及其表征:首先合成SA-DOX(SAD),从而在DOX的氨基上修饰上羧基,再将SAD偶联到NH2-PEG-NH2上,通过改良纳米沉淀法制备PD纳米粒。然后,将适量HN-1-NHS投入到PD纳米粒溶液中,通过与制备PD纳米粒相同的方法,获得HPD纳米粒的水溶液。使用电位-粒径分析仪测定PD、HPD纳米粒的粒径大小、分布,并通过HT7700透射电子显微镜观察其形貌。3.HPD纳米粒的体外稳定性研究:HPD纳米粒的稳定性分析,将HPD纳米粒溶液分别用H_2O、PBS和含10%FBS的PBS稀释保存,并于第1、3、5、7天分别测量其粒径大小和分布变化。4.HPD纳米粒的体内作用研究:药物代谢动力学实验考察HPD纳米粒在大鼠体内的药代动力学行为,构建OSCC异体移植瘤模型并用小动物活体成像技术考察HPD纳米粒在肿瘤组织以及正常器官的分布情况:将荷瘤裸鼠分为生理盐水组(空白对照组),游离DOX组,PD和HPD纳米粒组,各实验组裸鼠均按DOX当量为8.0 mg/kg分别经尾静脉注入游离DOX、PD和HPD纳米粒溶液。8小时和24小时后,采用脊椎脱臼法处死各组1只裸鼠,完整收集成瘤裸鼠腹股沟皮下肿瘤组织和主要器官,于小动物活体成像系统下观察分析DOX荧光在肿瘤组织以及正常器官的分布情况。结果1.流式细胞仪测定多肽入胞率的结果显示,HN-1能更加显著地被OSCC细胞CAL-27和SCC-25摄取,并且与Ir相比,其细胞摄取率达3倍以上;同时,这两种肽在肝癌细胞HepG2中的入胞率均较低。2.成功合成了HPD纳米粒,HPD纳米粒呈规则的球状分布,粒径均一,大小为150±5.0 nm,多分散系数(PDI)为0.206±0.012。3.HPD纳米粒分别在3种溶剂H_2O、PBS、10%FBS中保存1、3、5、7天后粒径大小及分布均无明显变化,制备的HPD纳米粒稳定性良好。4.PD和HPD纳米粒组在大鼠体内的循环时间、最大血药浓度明显高于游离DOX组,经纳米技术包载药物后可以显著延长其在体内的循环时间,长时间维持有效药物浓度,增强抗肿瘤作用。给药后,PD和HPD纳米粒改变了DOX的组织分布,与游离DOX相比,PD和HPD纳米粒递送的DOX在肿瘤的分布显著增强;此外,由HPD纳米粒递送,在肿瘤中蓄积的DOX明显多于PD纳米粒,HN-1的表面修饰实现了纳米粒对OSCC的主动靶向递送。结论本研究成功验证了HN-1对OSCC细胞的靶向性;成功合成了HN-1表面修饰DOX的纳米粒HPD;HPD纳米粒在体内外具有较好的稳定性;能够延长药物在血液中的循环时间,维持有效的药物浓度;同时,在荷瘤小鼠中,HPD纳米粒改变了DOX的组织分布,能将DOX成功递送到肿瘤组织,增强了抗肿瘤疗效,降低了DOX的毒性作用。与PD纳米粒相比,由HPD纳米粒递送的DOX显示出更强的肿瘤分布特性,具有特异性靶向治疗OSCC移植瘤的能力。
【图文】：

多肽,流式,细胞

图 1 多肽 NH-1 和 Ir 在细胞 CAL-27、SCC-25 和 HepG2 中的流式图及入胞率比较1.3 讨论流式细胞术是一种利用流式细胞仪进行单细胞定量分析以及分别筛选出来的技术，是单克隆抗体技术、细胞免疫化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展以及综合利用的产物［23］。流式细胞仪是对细胞特性进行自动分析和分选的装置，它可以快速地测量分析、存储、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参数，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。此处应用 FITC 作为荧光标记，作为参量观察两种肽进入细胞中，从而将这种细胞分选出来，用来比较。Jozsef Dudas, Christin Idler 等人为了研究 HN-1 多肽对 HNSCC 的靶向性，，通过 HN-1 多肽与三组细胞：BEAS-2B、SCC-25 和 Detroit562 分别培养 24 小时后，得出 HN-1 多肽在 SCC-25、Detroit562、BEAS-2B 的摄取率依次为：56.15%，

粒径分布,纳米粒,粒径大小,粒径分布

制备 HPD 纳米粒时，将 30 mg HN-1-NHS 加入到上述 PD 纳米粒的胶液中，然后在室温下搅拌反应 48 h。之后，通过与制备 PD 纳米粒相同的方理反应物胶体溶液，由此获得 HPD 纳米粒的水溶液。相同条件下，重复组上述合成反应，均在避光条件下完成。使用粒径分析仪分析 PD、HPD 纳的粒径大小及其分布，得平均值，并通过 HT7700 透射电子显微镜观察其粒貌。2.2 结果2.2.1 PD、HPD 纳米粒的制备避光条件下成功合成了 PD、HPD 纳米粒冷冻干燥产物及相对应的纳米液。2.2.2 PD、HPD 纳米粒的表征PD、HPD 纳米粒在电镜下呈规则的球状分布，粒径大小依次为 140 ±5150 ±5.0 nm，多分散系数（PDI）依次为 0.232 ±0.004、0.206 ±0.012，见表 1。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.8

【参考文献】