内质网应激在胃癌曲妥珠单抗耐药发生与传递中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-08 18:21

【摘要】：研究背景胃癌(Gastric carcinoma,GC)是世界范围内发生率排名第四的恶性肿瘤,其死亡率占所有癌症死亡的第二位。曲妥珠单抗(Trastuzumab,商品名Herceptin)是一种靶向作用于人表皮生长因子受体2(Hunman epidermal growth factor receptor2,HER2)的人源化单克隆抗体,主要通过拮抗HER2信号转导通路的传递而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。与单纯化疗相比,曲妥珠单抗联合化疗显著延长了 HER2阳性晚期胃癌患者的生存期。但是,曲妥珠单抗耐药严重影响了胃癌患者的临床疗效。目前,曲妥珠单抗耐药现象已成为胃癌临床治疗亟需解决的重要问题之一。近年来的研究证实,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与肿瘤耐药关系密切。在细胞缺氧、糖供应不足、钙离子稳态失衡等情况下,肿瘤细胞均可引发ERS,并通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),增强自身对损伤的抗性及其存活能力。作为一种内源性的细胞适应性保护机制,ERS可参与调控肿瘤细胞耐药,但其在胃癌曲妥珠单抗耐药中的作用及其机制尚不清楚。mircroRNA是一种内源性基因调节因子,对肿瘤细胞的发生、发展及耐药具有重要的调节作用,并且广泛参与ERS的信号调节通路。在肿瘤微环境中,外泌体作为miRNAs的重要载体,可防止其降解。此外,外泌体作为细胞间信号交流的一种形式,与肿瘤的发生发展及耐药性的传递密切相关。本课题拟重点探讨ERS在胃癌曲妥珠单抗耐药发生与传递中的作用及其机制。内容和方法1.HER2阳性胃癌细胞内质网应激模型建立:以ERS激活剂Thapsigargin(TG)或无糖培养基(-Glu/FBS)分别处理HER2阳性胃癌细胞株,处理后不同时间点以Western blot检测GRP78的蛋白表达。2.CCK8法检测不同状态胃癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性差异。3.microRNA芯片筛选平台技术对正常状态胃癌细胞及其在ERS状态下的miRNA表达谱进行差异筛选。4.采用阳离子脂质体法进行细胞瞬时转染miRNA抑制剂或阴性对照,转染48h后加用TG处理,CCK8法检测细胞对曲妥珠单抗的敏感性变化。5.采用超速离心法进行外泌体的分离纯化;透射电子显微镜观察外泌体形态;颗粒粒度分析仪检测外泌体数量和大小分布;Western blot检测外泌体表面标志性蛋白CD63和CD81的蛋白表达。6.以不同状态胃癌细胞来源的外泌体孵育受体胃癌细胞,CCK8法检测受体细胞对曲妥珠单抗敏感性的变化。7.实时荧光定量 PCR 法(Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR QRT-PCR)检测细胞或外泌体中miRNA的表达水平。8.Western Blot 法检测细胞 GPR78、ERK、p-ERK、AKT 和 p-AKT 蛋白的表达水平。9.统计学方法:实验数据用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVAtest),两组间比较采用t'检验(two-tailed Student's t-test)。P0.05为差异有统计学意义。结果1.ERS状态下HER2阳性胃癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性显著降低。2.ERS状态下HER2阳性胃癌细胞的miRNA表达发生显著变化;筛选其中表达显著升高的11条miRNA,以相应的miRNA inhibitor下调其表达;结果发现,通过下调miR-301a-3p的表达,ERS诱导产生的曲妥珠单抗耐药性明显减弱,p-ERK和p-AKT蛋白表达在曲妥珠单抗的作用下明显下调;而GRP78的表达并不受miR-301a-3p表达水平的影响。3.经ERS状态HER2阳性胃癌细胞的培养液上清或ERS状态HER2阳性胃癌细胞释放的外泌体孵育后,受体细胞对曲妥珠单抗的敏感性显著降低,GRP78的表达未升高,p-ERK和p-AKT蛋白表达在曲妥珠单抗的作用下未出现下调。4.ERS状态下HER2阳性胃癌细胞释放的外泌体,其miR-301a-3p表达水平显著升高;经ERS状态细胞释放的外泌体处理后,受体胃癌细胞的miR-301a-3p表达水平显著升高;经转染miR-301a-3p inhibitor的ERS状态胃癌细胞来源的外泌体孵育后,受体细胞对曲妥珠单抗不产生耐药性。结论1.ERS诱导HER2阳性胃癌细胞对曲妥珠单抗产生耐药。2.ERS通过miR-301a-3p的过表达参与调控HER2阳性胃癌细胞对曲妥单抗的耐药。3.ERS状态HER2阳性胃癌细胞通过释放外泌体将耐药性传递至受体胃癌细胞。4.ERS状态HER2阳性胃癌细胞释放的外泌体通过转运miR-301a-3p的方式传递耐药性。
【图文】：

ＧＲＰ７８的蛋白表达水平在１２ｈ明显升高；－Ｇｌｕ／ＦＢＳ作用胃癌细胞ＮＣＩ－Ｎ８７逡逑０、６、１２、２４及４８ｈ后，ＧＲＰ７８的蛋白表达水平在２４ｈ明显升高。提示ＴＧ和逡逑－Ｇｌｕ／ＦＢＳ激活胃癌细胞产生ＥＲＳ的最佳时间点分别为１２ｈ和２４ｈ邋（图１－１，卜逡逑２）。逡逑ＴＧ（１邋ＪＩＭ）邋Ｏｈ邋３ｈ邋６ｈ邋１２ｈ逦２４ｈ逡逑ＧＲＰ７８逦■＝邋ＴＯＭ逡逑｜ｉ－Ａｃｔｉｎ逡逑ＮＣＩ－Ｎ８７逡逑图丨－１．邋ＴＧ处理胃癌细胞ＮＣＩ－Ｎ８７不同时间后ＧＲＰ７８蛋白表达水平逡逑－Ｇｌｕ／ＦＢＳ邋Ｏｈ邋６ｈ邋１２ｈ逦２４ｈ逦４８ｈ逡逑ＧＲＰ７８逦？．逡逑ｐ－Ａｃｔｉｎ逡逑ＮＣＩ－Ｎ８７逡逑图１－２．邋－Ｇｌｕ／ＦＢＳ处理胃癌细胞ＮＣ１－Ｎ８７不同时间后ＧＲＰ７８蛋白表达水平逡逑１．３＿２邋ＴＧ或－Ｇｌｕ／ＦＢＳ激活胃癌细胞产生ＥＲＳ的持续时间逡逑为明确胃癌细胞激活ＥＲＳ后，ＥＲＳ反应可持续的T间，ＴＧ（邋１邋ｐｍ）或－Ｇｌｕ／ＦＢＳ逡逑分别作用细胞１２ｈ或２４ｈ后，更换正常培养基，于不同时间点收集细胞蛋白，以逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＧＲＰ７８的表达水平。逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示：ＴＧ或－Ｇｌｕ／ＦＢＳ激活胃癌细胞ＮＣＩ－Ｎ８７产生ＥＲＳ逡逑后２４、４８、７２及２９６ｈ，ＧＲＰ７８的蛋白表达水平仍明显升高（图１－３，１－４）。逡逑１４逡逑

与正常态胃癌细胞相比，，处于ＥＲＳ状态的胃癌细胞对曲妥珠逡逑单抗的敏感性显著降低，即耐药性增加，提示ＥＲＳ可诱导胃癌细胞对曲妥珠单逡逑抗产生耐药（图１－５，１－６）。逡逑１５逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 陈世灵;张勤勇;;某院2015-2016年曲妥珠单抗应用分析[J];临床医药文献电子杂志;2017年68期

2 佚名;;什么情况下可以使用曲妥珠单抗?[J];现代医院;2018年02期

3 赵冬梅;陈静;李晶;陈姝羽;吉铁凤;;注射用曲妥珠单抗安全输注问题与建议[J];武警医学;2016年10期

4 任重阳;;老年早期乳腺癌辅助曲妥珠单抗的持续时间和心脏事件[J];循证医学;2014年02期

5 向纯明;;曲妥珠单抗引起多重不良反应1例报告[J];中国实用医药;2012年27期

6 王璐;武贵存;魏长宏;王作志;;曲妥珠单抗治疗乳腺癌致精神症状1例报告[J];山东医药;2011年49期

7 胡夕春;王佳蕾;;曲妥珠单抗(赫赛汀)最新临床研究进展[J];临床药物治疗杂志;2004年06期

8 洪亮;;接受曲妥珠单抗治疗的女性要密切随访[J];心血管病防治知识(科普版);2011年11期

9 郭艳丽;薛剑;李军;郑本献;冯霞;张孝忠;;超敏肌钙蛋白I和N末端B型钠尿肽原对曲妥珠单抗致心脏毒性的预测价值[J];武警医学;2017年08期

10 刘宝利;郑守华;陈楠;李虹;张婧;周岩;刘晓舟;;注射用曲妥珠单抗计算量表的设计与应用[J];护理研究;2014年13期

相关会议论文 前10条

1 赵冬梅;;细节管理在注射用曲妥珠单抗安全输注中的应用[A];湖南中医药大学学报2016/专集：国际数字医学会数字中医药分会成立大会暨首届数字中医药学术交流会论文集[C];2016年

2 樊蕴莉;张琳;;曲妥珠单抗治疗转移性乳腺癌的护理[A];中华护理学会全国肿瘤护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2010年

3 马飞;李俏;李慧慧;袁們;王佳玉;樊英;徐兵河;;曲妥珠单抗治疗拉帕替尼耐药乳腺癌的临床价值[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年

4 董国雷;佟仲生;李军楠;于洋;;重组人血管内皮抑制素联合曲妥珠单抗对Her-2过表达[A];第八届中国肿瘤学术大会暨第十三届海峡两岸肿瘤学术会议论文汇编[C];2014年

5 杨秀娟;王黎青;王勇;;1例复发转移乳腺癌患者曲妥珠单抗耐药后的用药分析[A];中华医学会临床药学分会2014年全国学术会议论文汇编[C];2014年

6 王晓稼;;HER-2阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药机制研究进展[A];2013华东胸部肿瘤论坛暨第六届浙江省胸部肿瘤论坛论文集[C];2013年

7 胡伟国;;从国际最新进展看国内抗HER2治疗的现状与发展[A];湖北省抗癌协会青年委员会第五届青年学术论坛资料汇编[C];2013年

8 董良;李海金;;乳腺癌新型分子靶向药物治疗研究进展[A];2013年第六届国家级分子靶点药物治疗新进展学习班暨浙江省肿瘤化疗学术年会论文集[C];2013年

9 张童童;李青;;乳腺癌抗HER-2耐药后的治疗策略[A];中国肿瘤内科进展 中国肿瘤医师教育（2014）[C];2014年

10 应晓;;曲妥珠单抗治疗乳腺癌的不良反应的护理[A];国家级胸部肿瘤治疗护理新进展学习班暨2013浙江省抗癌协会肿瘤护理年会论文集[C];2013年

相关重要报纸文章 前10条

1 本报记者 戴小河;生物类似药研发呈蓬勃之势[N];中国证券报;2017年

2 驻京记者 贾岩;曲妥珠单抗能做得更多[N];医药经济报;2010年

3 张骁;束梅英;曲妥珠单抗治疗乳腺癌研究[N];中国医药报;2004年

4 麦迪信医学出版有限公司供稿;用得准 好药才见良效[N];医药经济报;2003年

5 闻声;曲妥珠单抗可用于乳癌辅助治疗[N];中国医药报;2007年

6 新汶;欧洲批准曲妥珠单抗用于早期HER2阳性乳腺癌[N];医药经济报;2006年

7 陶春祥;曲妥珠单抗治疗乳腺癌[N];中国医药报;2002年

8 汤森路透;我国生物类似药发展机遇与挑战并存[N];中国医药报;2015年

9 KERRI WACHTER;赫赛汀遭遇供应和费用难题[N];医药经济报;2012年

10 编译 李勇;请留意这11类生物类似药[N];医药经济报;2014年

相关博士学位论文 前10条

1 史蛟龙;HER4-YAP1轴通过诱导HER2阳性胃癌细胞上皮间质转化促进曲妥珠单抗的耐药[D];南方医科大学;2018年

2 赵玮;基于真实世界数据探索抗HER2靶向治疗优选方案及耐药机制[D];军事科学院;2018年

3 李健斌;循环肿瘤细胞在人表皮生长因子受体2阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药机制的探索性研究[D];军事科学院;2018年

4 曹岚清;YAP对HER2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性的影响及相关机制研究[D];吉林大学;2018年

5 李晓玲;曲妥珠单抗联合5-氟尿嘧啶和/或顺铂治疗胃癌的实验研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年

6 李光超;反馈激活的STAT3通过上调MUC1和MUC4的表达介导曲妥株单抗耐药[D];华南理工大学;2014年

7 李瑞麟;新型抗HER2人源化抗体HuA21的抗肿瘤作用及机制研究[D];安徽医科大学;2016年

8 柳萌;曲妥珠单抗联合唑来膦酸促进Vγ9Vδ2T细胞免疫治疗骨肉瘤的实验研究[D];浙江大学;2016年

9 罗波;EGFR家族成员在肿瘤细胞辐射抵抗中的作用机制研究[D];华中科技大学;2009年

10 冯辉;自然杀伤细胞联合曲妥珠单抗增强对曲妥珠单抗耐药乳腺癌细胞的杀伤作用[D];吉林大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 郭静;内质网应激在胃癌曲妥珠单抗耐药发生与传递中的作用及机制研究[D];南方医科大学;2018年

2 潘淋淋;分子靶向药物一线治疗晚期HER2阳性乳腺癌的网状Meta分析[D];吉林大学;2018年

3 杨柳婷;NRG1/HER3通路激活致HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗原发耐药作用机制的研究[D];山西医科大学;2018年

4 陈杰;曲妥珠单抗联合奥沙利铂对HER2阳性胃癌细胞增殖及细胞活性的影响[D];苏州大学;2017年

5 阮贝鸿;探索乳腺癌细胞系中曲妥珠单抗耐药相关的生物标志物[D];浙江大学;2016年

6 韩思奇;曲妥珠单抗与塞卡替尼在胃癌中的抗肿瘤作用及其机理研究[D];中国人民解放军医学院;2013年

7 申晓倩;曲妥珠单抗诱导大鼠心功能降低及其机制的探讨[D];山东大学;2014年

8 李娟;回顾性研究曲妥珠单抗联合化疗治疗HER2阳性晚期胃癌的临床疗效、安全性及治疗前后HER2状态及耐药基因的研究[D];中国人民解放军医学院;2017年

9 郭艳丽;生物标志物联合检测对早期乳腺癌曲妥珠单抗联合化疗心脏毒性的预测价值[D];中国人民解放军军事医学科学院;2017年

10 王亚楠;新型抗肿瘤药物不良反应调查分析[D];山东大学;2014年

本文编号：2655018