三氧化二砷对缝隙连接蛋白43表达的影响及参与非肌层浸润膀胱癌半通道开放的研究

发布时间：2020-05-08 16:11

【摘要】：研究背景:泌尿系统肿瘤中最常见的就是膀胱癌,主要是指膀胱黏膜细胞发生癌变,其中尿路上皮发生癌变(即临床常说的移行细胞癌)最为常见。膀胱癌的发病率在世界范围内不断升高,在我国其已经成为泌尿系统内发病率最高的恶性肿瘤,并且其病死率呈每年逐步升高趋势。流行病学调查研究发现男性膀胱癌的发病率高出女性2-3倍之多,在中国恶性肿瘤发病率排行中,男性群体中膀胱癌发病率位于第8位,而女性排行则为第12位。临床研究发现,按照膀胱癌浸润程度划分,浅表性膀胱癌在临床极为常见。浅表性膀胱癌临床又将其称为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC),而非肌层浸润性膀胱癌现有的一线临床治疗方法中,经尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)是最常用的治疗方法之一,而早期手术被认为是膀胱癌预后效果的关键影响因素。早期手术虽然能够术切除大部分癌细胞,但是术后复发率、复发患者恶性程度上升等均已经称为膀胱癌致死的重要因素,因此早期手术后进行辅助抗癌就显得极为重要。膀胱内药物灌注免疫治疗在浅表性膀胱癌的治疗中已经被广泛认可,早期手术后辅以膀胱灌注化疗被认为不仅能够有效降低患者术后复发的风险,而且能够有效提升预后效果和生存率,但是目前仍有超过60%的癌症患者术后复发。卡介苗(Bacillus Calmette Guérin,BCG)膀胱灌注作为目前临床治疗浅表性膀胱癌一线免疫治疗方案,是膀胱癌辅助抗癌金标准疗法之一,被认为是灌注化疗失败后最有效的方法,但仍有30-45%病人对BCG治疗无反应,20%患者不能耐受其毒副作用。而且仍有一定比例病人不能耐受其毒副作用如出血性膀胱炎、造血和免疫功能抑制等,严重降低患者日常生活的质量。因此,改善BCG抗癌疗效、降低毒副作用是目前膀胱癌灌注治疗研究的热点。BCG联合化疗药物是目前可应用于临床的方法,效果与BCG单独应用的效果更具优势,而且有利于降低BCG有效治疗所需剂量。三氧化二砷(缩写为As2O3,即ATO)作为我国中医药体系中传统治疗药物——砒霜最重要的药物成分,能够有效治疗包括梅毒、结核、癌症等多种疾病,临床上历史悠久,上个世纪90年代我国科研工作者发现其能够靶向性治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)并取得了突出的疗效,自此三氧化二砷的抗肿瘤活性引起了世界性的关注。在1999年,中国国家食品药品监督管理局(即SFDA)就已经审核通过了ATO注射液的生产申请,并允许其在临床治疗中应用,而美国食品与药物管理局相继在2000年通过了关于ATO注射液在美国上市的申请,将其批准成为复发/难治性APL治疗的二线药物。三氧化二砷对血液系统疾病疗效显着,通过观察分析ATO应用到血液系统肿瘤患者之后的效果发现,使用ATO之后血液系统肿瘤治疗效果(完全缓解率)、远期生存率等显著提高,且复发率明显下降、不良反应明显减轻,并且其并会与所用的其他化疗药物发生交叉耐药的现象。近年来,在实体肿瘤的临床治疗中,ATO的应用范围不断拓展,肺癌,乳腺癌,胃癌,前列腺癌,结肠癌,卵巢癌;肝癌等诸多实体肿瘤中均有其研究报道所查。目前诸多体内外相关实验表明ATO作为肿瘤治疗药物,对肿瘤细胞凋亡具有选择性诱导作用,而且能够不影响正常细胞的凋亡过程及抗肿瘤血管生成作用。但ATO的抗肿瘤作用具有明显的剂量和时间依赖特性,ATO治疗窗比较窄,大剂量ATO对正常细胞有明显的毒性作用,因此有效的给药途径和用药剂量是决定ATO临床疗效的关键。选择较低且有效的药物浓度,在保证抗肿瘤疗效的同时减少副作用是临床用药的基本原则。连接蛋白(Connexin,Cxs)有趋同的基本架构,具体结构的组成成分同时含有疏水跨膜片段(共4个)和亲水段,其中亲水段的位置在胞内环(1个)与胞外环(2个,组成成分均是6个保守性半胱氨酸残基)之间,而蛋白羧基末端、氨基末端全部存在于胞质之内。Cxs具有多种不同形式的羧基末端,是公认的关键部位,并在蛋白间相互作用过程中发挥着极其重要的调节作用。细胞缝隙连接(Gap junction,GJs)是由两个细胞缝隙连接蛋白六聚体互相对接形成的跨膜通道结构,在细胞表面还存在着许多未配对的半通道,与细胞缝隙连接有着相似的通透特性。细胞缝隙连接蛋白的半通道允许细胞交换分子量为1000D以下的离子、代谢产物、离子(K~+、Ca~(2+))、白介素(IL-6、IL-10)和其他第二信使(cAMP、GSH、cGMP、NO和IP_3等),大分子则不允许通过(小RNAs除外),在沟通细胞间及细胞与基质间信息,调控细胞代谢,增殖分化中发挥重要作用,已经有超过20种细胞缝隙连接蛋白被鉴定,几乎所有其它类型的细胞都有GJs的存在,除外骨骼肌、成熟的红细胞及精子,组织表达分布最广与肿瘤的关系最密切的是Cx43,在多种恶性肿瘤细胞中Cx43的表达下调与肿瘤的发生、发展及转移有关。在膀胱癌组织中的研究证实,肿瘤病灶周围的正常膀胱组织,其细胞内的Cx43蛋白多表现出高水平表达状态,在膀胱尿路上皮癌细胞中低表达。Cx43的基因突变极少见,其表达及功能的调控主要在转录及转录后水平进行。目前已经发现ATO可能通过调节CX43表达产生生物学效应,但是由于目前相关机制以及ATO联合BCG抗肿瘤效应、机制的研究仍属于空白。研发新型膀胱癌治疗药物不仅需要进行体外实验研究,而且需要进行体内实验模型建立并进一步证实其对机体的有效性和安全性。现今医疗研究中,膀胱癌的体外模型建立方法中最常用的就是向体内输注人膀胱癌细胞,该方法建立的实验模型不仅能够用于膀胱癌发生机制的各项研究中,而且能够初步评价抗膀胱癌治疗药物在体内应用的效果和安全性。体外动物模型建立的优势在于实验条件具有可控制性、操作方便、实验耗时较短,而且研发费用极为低廉;但是其缺点也极为明确,目前所用的膀胱癌细胞系其肿瘤细胞种类单一,并且均在体外生长,在生长方式、生长微环境、细胞构成种类方面不能够与人体膀胱癌细胞完全一致,因此其无法完全模拟人体膀胱癌组织发生病变特点,无法代表化疗药物毒副反应,由此可见,单纯体外研究成果并不能够完全反应化疗药物在体内作用的有效性、安全性,建立体内实验模型评价化疗药物治疗恶性肿瘤可行性是极为必要的。虽然目前恶性肿瘤动物模型建立过程可供选择的动物种类较多,但是最常用的动物种类仍然是小鼠或者裸小鼠,主要原因在于鼠类体型较小、繁殖时间短、遗传基因与人类有清晰的同源性、且生理生化代谢过程特点与人类高度相似,因此,相较于其他种类动物模型,裸小鼠恶性肿瘤模型能更好论证化疗药物可行性、有效性和安全性,并能够初步反应出药物体内代谢过程和动力学特点,因此,在膀胱癌新药研发中进行动物在体实验是必须的。鉴于此,本研究将利用人膀胱癌细胞系BIU-87、T24、5637等膀胱癌细胞株先设计特定的与临床极其相关的体外实验体系,随后建立膀胱癌异位移植瘤裸小鼠动物模型,通过体外细胞层次研究、实验动物在体实验研究两个层次综合分析三氧化二砷成为膀胱癌灌注化疗药物的可行性,通过体内、体外充分论证其药物治疗的有效性、安全性,为临床应用三氧化二砷治疗膀胱癌奠定实验基础,为临床推广中医药抗肿瘤治疗奠定科学而坚实的理论基础。本实验的主要目的是:(1)体外培养人膀胱癌细胞系BIU-87、T24、5637等膀胱癌细胞特定的体外细胞培养实验,通过多种实验技术及手段,确立膀胱癌模型建立方法(2)体外培养人膀胱癌细胞系,通过给予不同浓度的ATO,模拟ATO不同给药剂量对于肿瘤细胞增殖的影响,同时通过从细胞和分子层面针对三氧化二砷影响缝隙连接蛋白43与抗肿瘤作用的关系进行探讨。(3)膀胱癌皮下移植瘤小鼠模型建立过程中,选取的膀胱癌细胞种类为5637,细胞注射方式为皮下注射,通过腹腔注射不同药物的方法,分析干预方法对于肿瘤细胞的影响,初步分析ATO联合BCG膀胱灌注治疗膀胱癌移植瘤的效果和可能的抗肿瘤效应作用机制。方法:将NBT-II膀胱癌细胞株、BIU-87型膀胱癌细胞株、5637型膀胱癌细胞株、T24膀胱癌细胞株以及PBS细胞株进行体外传代培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中,细胞体外培养进入对数生长阶段之后,利用专用细胞平体外培养基对目标细胞进行重悬,调整细胞浓度,分别注射到Balb/c雌裸小鼠体内,根据所注射细胞的不同,将小鼠分为5组,分组结果为5637组、NBT-II组、BIU-87组、T24组以及PBS组,观察分析小鼠皮下肿瘤形成和生长情况,确定膀胱癌建模细胞种类,为体内实验建模奠定基础。1、利用5637膀胱癌细胞株建立模拟临床膀胱癌术后膀胱灌注化疗药物的体外实验体系,根据干预方法的不同分为6组,依次为正常培养组(实验过程中未添加任何对细胞有影响的干预措施)、5μmol/L组(As2O3应用剂量为5μmol/L)、10μmol/L组(As2O3应用剂量为10μmol/L);、15μmol/L组(As2O3应用剂量为15μmol/L)、20μmol/L组(As2O3应用剂量为20μmol/L)、25μmol/组(As2O3应用剂量为25μmol/L),在完成细胞体外药物干预之后,在干预的24h、48h分别完成细胞增殖情检测况,同时对不同干预方法的各组的蛋白表达水平予以测定,其中蛋白检测指标包括Cx43、Nrf2、JNK、JNK-1,检测方法是western blot,基因检测指标是Cx43,检测方法是PCR法,采用CCK-8检测膀胱癌细胞存活率、应用流式细胞技术观察ATO对细胞凋亡情况的影响,从分子水平、基因水平对三氧化二砷对缝隙连接蛋白43及半通道的作用与抗膀胱癌作用的内在分子机制进行检测和分析,检测Cx43表达改变。2、选取5637作为膀胱癌动物模型建立的细胞株经皮下注射癌细胞并成功建立移植瘤模型之后,当平均肿瘤体积达100mm~3~150mm~3大小时,依据瘤体积、裸鼠体重,遵循均衡随机原则,将模型鼠平均分为为4组,每组中实验动物模型均为9只,各组小鼠的肿瘤体积等差异均未超过均值的10%,并且按以下方案^u始给药:(1)三氧化二砷组:给予As2O3 10mg/kg;(2)Gap26组,Gap26阻滞后给予As2O310mg/kg;(3)空白对照组,不添加药物及阻滞剂,仅给予0.9%NaCl;(4)联合组,As2O3 10mg/kg+卡介苗(BCG)100g,连续干预10天,观察记录干预前后各组分别处理小鼠,观察对比瘤积和瘤重变化,同时各组移植瘤小鼠Cx43表达水平进行测定,从分子水平对As_2O_3与BCG对缝隙连接蛋白43的作用与抗膀胱癌作用的内在分子机制进行检测和分析。3、统计学处理:采用统计学专业软件(SPSS 13.0)对实验数据进行分类、整理和统计学分析,其中在分析不同阻滞剂在不同处理时间下对Cx43,p-Cx43总蛋白的影响需要行析因分析。对时间、阻滞剂单独效应等资料进行分析时则需用单因素方差分析,如果数据的方差不齐时,则需要以welch校正法对数据进行校正,方差不齐数据的分析方法为DunnettT3法。满足方差齐性条件的数据在分析时,按照均数士标准差(x±s)形式将数据表示后,多组间两两比较的方法是LSD法,多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),等级资料均以非参数检验(Independent Samples Test)完成,显著性评价水准是a=0.05,P0.05认为有显著性。结果:1、BIU-87组、5637组、NBT-II组和T24组在实验过程中各组裸鼠状态好,体重无明显下降,无提前死亡小鼠出现,实验中全部所用小鼠在实验过程中并无严重不良反应显现,均饮食排便正常。在注射相同浓度细胞悬液的情况下,按肿瘤体积大于0.1cm~3为成瘤标准,NBT-II组出瘤率最高,其次为5637组,各组裸鼠的膀胱癌出瘤率存在明显差异(P0.05);裸鼠皮下移植性膀胱癌模型裸鼠体重随着时间变化而体重明显改变(P0.05),NBT-II组和5637组在肿瘤体积、肿瘤重量以及增长速度方面并无明显差异(P0.05)。2、CCK-8方法显示As2O3处理膀胱癌细胞在浓度10umol/LAs2O3即可产生明显抑制增殖效果,且As2O3抑制效果呈明显浓度依赖效应关系,LD50约为20umol/L;Western Blot对蛋白定量分析显示:和对照组定量分析结果比较,处理12h后,As2O3对Cx43、Nrf2、JNK及JNK-1蛋白表达都有明显的上调,随着药物剂量增加而增加,不同As2O3处理间具有统计学差异(P0.05)。3、在给药之前,各组裸鼠瘤积未见无显著性差异(P0.05),应用药物干预之后,As2O3组、联合组裸鼠的瘤积、瘤重均出现大幅下降,与本组给药治疗前比较,数据有显著性变化(P0.05);而且在经过药物治疗后,联合组瘤积、瘤重相较于其他各组,均处于显著低水平(P0.05),且As2O3组的瘤积和瘤重显著低于Gap26组和对照组,组间相比有统计学差异(P0.05);联合组、As2O3组瘤在体内均有大量坏死组织出现,且残存活性细胞的核分裂现象减少,部分区域可见肿瘤细胞无一不出现坏死、消失,而且在细胞内部,棕黄色颗粒多见且大量沉着,细胞染色结果大部分是阳性;Gap 26组肿瘤细胞坏死不明显,大部分肿瘤细胞生长旺盛,黄色颗粒沉着很少,细胞染色多为弱阳性,空白对照组的癌细胞表现促快速生长趋势,核分裂多见,黄色颗粒沉着极为稀少,组间CX43水平差异显著(P0.05)。结论:人膀胱癌T-24、BIU-87、5637细胞在成瘤率方面具有明显差异,在建立膀胱癌模型过程中应选用成瘤较高、稳定性较好、且为人源性的5637细胞进行模型建立。体外实验体系中,低浓度的三氧化二砷即可以有效抑制生长,并使缝隙链接蛋白43表达上调,而且三氧化二砷抑制效果具有明显的时间和剂量依赖性,使用半通道特异性阻滞剂后三氧化二砷抗肿瘤效用明显减低,提示三氧化二砷抗肿瘤作用与半通道开放有关。三氧化二砷与BCG合用能够明显上调缝隙链接蛋白表达,抑制裸小鼠皮下膀胱癌细胞移植瘤的生长,其效果明显优于三氧化二砷单独使用。综上所述,本课题立足于临床治疗效果,从体外实验、在体实验两种不同实验体系分别揭示了中药砒霜主要成分——三氧化二砷的抗肿瘤效果,初步明确了其成为膀胱癌术后新型辅助治疗药物的可行性、有效性、安全性,在医学研究领域初步明确了三氧化二砷具有重要抗肿瘤治疗应用价值。
【图文】：

膀胱癌,博士学位论文,参考线,药物

MAPK信号通路Figure1MAPKsignalpathway

膀胱癌

2 结果2.1 各组小鼠成活情况实验过程中各组裸鼠状态好，体重无明显下降，无明显并发症，无提前死亡小鼠出现，且实验中全部入选小鼠并没有严重不良反应出现，进水、饮食、二便均无异常。2.2 在相同条件不同膀胱癌细胞出瘤率比较在每组注射相同浓度细胞悬液的情况下，按肿瘤体积大于 0.1cm3为成瘤标准，NBT-II 组出瘤率最高，在其腹部可见明显肿瘤突出形成（图 2），其次为 5637 组（图3），而其他三组几乎未见成功出瘤，，各组裸鼠的膀胱癌出瘤率存在明显差异（P<0.05）。见表 1。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14

【参考文献】