Tbx2在胃癌中过表达并促进胃癌增殖侵袭和上皮间质转化

发布时间：2020-05-09 05:44

【摘要】：前言:我国胃癌死亡率排名第二,是仅排在肺癌之后的恶性肿瘤。尽管在过去的几十年里发展中国家的胃癌发病率有所下降,但其依旧是发展中国家十分重要的健康威胁。尽管外科手术以及辅助治疗的手段在不断进步,但与其他恶性肿瘤相比,胃癌预后总体情况仍然表现不佳。由于早期胃癌临床症状并不明显,许多胃癌患者在确诊时已处于肿瘤中晚期阶段,而此时胃癌多具有高侵袭性、高转移性和高死亡率的特点,胃癌患者5年生存率仅为20%-30%。因此,寻找能够影响胃癌进展的分子信号通路,明确胃癌发生发展的分子机制,对胃癌的早期诊断和研发中晚期胃癌的治疗药物具有十分重要的作用。TBX2属于T-box gene(TBX)家族成员,从低等无脊椎动物到人类等许多物种中广泛存在。所有TBX转录因子都有一个保守的T-box结构域,该结构域与特定的DNA序列结合,能够发挥转录刺激或转录抑制因子的作用。TBX2定位于人的17q23染色体,在上下肢,乳腺,肺脏,心脏,眼以及肾脏等组织器官的发育中具有重要作用。TBX2蛋白作为转录因子,可以调控细胞周期进展、促进细胞增殖、迁移、抑制细胞凋亡,能够在细胞分化前促进前体细胞的增生和生存。近期的研究表明TBX2是可以促进肿瘤进展的癌基因,TBX2首先被发现在人乳腺癌细胞中存在过表达,并且与乳腺癌的不良预后密切相关。随后大量研究表明TBX2过表达在多种人类肿瘤中普遍存在。TBX2能够促进肿瘤细胞增殖,TBX2通过直接调节细胞周期蛋白Cdkn2a(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)和p21等表达起到促进肿瘤细胞增殖的作用。另外,TBX2还与DNA损伤密切相关,在BRCA1和BRCA2相关的乳腺癌中TBX2呈现扩增,并且与DNA损伤应答相关。TBX2可以促进肿瘤的侵袭和转移,在鼠乳腺癌模型中TBX2促进细胞发生上皮间质转化(EMT)并促进肿瘤细胞发生侵袭和转移。然而,TBX2在胃癌中的临床意义及生物学功能仍不清楚。本实验旨在研究TBX2蛋白在胃癌组织及正常胃组织的表达情况,分析其与临床病理因素之间的相关性。检测TBX2在胃癌细胞中的表达含量,分析其对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响。同时探讨TBX2在胃癌中发挥生物学作用时所依赖的分子机制。目的:分析胃癌组织中TBX2的表达量与临床病理因素之间的关系。通过实验探讨TBX2对胃癌细胞生物学行为的影响,证明TBX2是胃癌中重要的致癌基因,为诊断和治疗胃癌提供新的靶点。方法:从2008-2010年在中国医科大学附属第一医院实施手术并且术前未行任何放化疗的患者中选取161例原发性胃癌样本和10例正常胃组织。组织经10%中性福尔马林液固定、石蜡包埋。通过免疫组织化学实验分析胃癌组织中TBX2的表达量与临床病理因素之间的关系。从ATCC和中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购买胃癌细胞系BGC-823、SGC-7901、AGS、GES1、MKN-1。通过细胞转染实验技术,实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹杂交实验观察TBX2在胃癌细胞中的表达情况。通过细胞集落生成实验和MTT检测转染TBX2后胃癌细胞增殖情况。通过基质胶实验观察转染TBX2后胃癌细胞侵袭情况。结果:TBX2在胃癌组织中过表达:采用免疫组化方法检测TBX2蛋白在161例胃癌标本及10例正常胃组织中的表达情况发现TBX2蛋白在细胞核和细胞浆中均存在染色。在161例胃癌组织中,55.9%(90/161例)呈TBX2高表达;而在正常胃组织中,仅呈TBX2阴性表达。TBX2蛋白表达与胃癌临床病理因素相关性:进一步分析TBX2表达与临床病理因素的相关性,包括患者年龄,性别,组织分化程度,TNM分期等。我们发现TBX2的过表达与较高的TNM分期(p0.0001),肿瘤浸润深度(T期)(p=0.0460)和淋巴结转移(p=0.0051)显著相关。但是却没有发现TBX2与其他因素存在显著相关性。单因素回归分析显示TBX2表达、临床分期和复发能显著影响患者预后。Cox多因素回归显示分期和复发能独立预测患者不良预后。生存曲线和Log-rank检验显示TBX2与患者不良预后显著相关。TBX2促进胃癌细胞的增殖和侵袭:通过western blot技术检测胃癌细胞系中TBX2的内源表达量发现BGC-823细胞系内源表达量较高,而SGC-7901细胞系内源表达量较低。通过TBX2质粒转染以及siRNA干扰对这两个细胞系分别进行处理,结果显示TBX2质粒转染后能够显著上调TBX2的mRNA以及相应蛋白表达量,而siRNA干扰则能够明显下调TBX2的mRNA及蛋白表达量。通过MTT实验,我们发现TBX2转染后能够增强SGC-7901胃癌细胞系的增殖能力,而TBX2特异性siRNA干扰能够明显抑制BGC-823细胞的增殖能力。为了探究TBX2对于细胞侵袭所发挥的作用,进行transwell实验,实验结果表明TBX2质粒转染后细胞的侵袭能力显著增强,而TBX2干扰后细胞的侵袭能力降低(p0.05)。TBX2调控侵袭相关蛋白:通过体外细胞实验上调和抑制了TBX2的表达,然后筛查与细胞增殖和侵袭密切相关的蛋白的表达变化情况。实验结果显示与对照组细胞相比,TBX2过表达能够显著上调MMP2和MMP9蛋白的表达量,而TBX2干扰则抑制了这些蛋白的表达。结果说明TBX2可能通过MMP2或MMP9蛋白来调控胃癌细胞的增殖和侵袭。TBX2调控上皮间质转化:检测与上皮间质转化有关因子的表达量,结果显示TBX2过表达能够下调SGC-7901细胞系中E-cadherin的含量水平,而TBX2干扰会稍许上调E-cadherin的表达量。能够进一步证实在胃癌细胞系中,TBX2能够通过ERK-MMP-2信号通路促进细胞恶性表型的发生,同时可以加快细胞上皮间质转化这一进程。TBX2调控ERK信号通路:我们研究了MAPK信号通路:JNK,p38以及ERK,这些信号通路都是调控MMP-2表达的信号通路。我们发现TBX2过表达能够显著上调ERK的磷酸化水平,表明TBX2上调MMP-2的表达很有可能是通过诱导ERK信号通路的活化而进行的。TBX2调控细胞周期相关蛋白:通过研究细胞周期相关蛋白的变化情况。我们发现TBX2过表达能够明显上调cyclin E的表达水平,而敲除TBX表达则下调cyclin E的表达。另外TBX2转染抑制了p21的表达,而敲除TBX2表达会上调p21的表达,表明TBX2上调细胞增殖很有可能是通过对p21的抑制和对cyclin E的上调来实现的。结论:在胃癌进展过程,TBX2可以在人类胃癌组织中过量表达。TBX2过表达促进胃癌细胞的生长和侵袭。TBX2通过ERK-MMP和EMT介导胃癌细胞侵袭转移。还可以通过下调p21蛋白表达和上调cyclin E蛋白表达介导细胞增殖。
【图文】：

胃癌组织中TBX2蛋白质的表达（放大倍数,400X）

Tbx2在胃癌中过表达并促进胃癌增殖侵袭和上皮间质转化

TBX2在胃癌细胞系中的表达
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

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