人侵润的骨髓间充质干细胞通过外泌体促进肠癌细胞干性的实验研究

发布时间：2020-05-09 08:39

【摘要】：目的:肠癌的死亡率较高,在全球范围内,肠癌是肿瘤致死的三个主要原因之一。尽管在治疗肠癌方面已经取得了一定进展,发现了一些治疗肠癌的抗体类/小分子类的药物,然而临床标准治疗仍然依靠手术切除及术后放化疗。不仅如此,肠癌病人经常在综合治疗数年后,原发部位的肿瘤发生复发,并且并发转移瘤。由于手术切除并放化疗治疗后的肠癌细胞经常处于休眠状态,临床检测不到,因而,病人经常表现为无症状,以至于常常被忽视。这种休眠的肠癌细胞被认为是肠癌干细胞。肠癌干细胞即是指那些对放化疗抵抗,主要导致肠癌复发的一群肠癌细胞。人BM-MSCs细胞,即人骨髓间充质干细胞,是肿瘤干细胞微环境的主要细胞成分之一,因其本身即具有干细胞的特点,又是肿瘤微环境中的细胞成分,使得其在肿瘤细胞侵袭,转移,增殖等方面的研究备受关注。BM-MSCs细胞与肿瘤细胞的相互作用可以通过很多方式。可以在肿瘤微环境中,通过分泌各种细胞因子影响肿瘤微环境,也能够通过直接的与邻近的肿瘤细胞接触影响肿瘤细胞,因此,影响肿瘤细胞的发生发展。不仅如此,已经有研究显示MSC细胞能够利用专署的运输系统——exosomes。Exosomes或称为外泌体,是一种直径约50-100nm的分泌囊泡,其来源于细胞内的囊泡系统,能够被一些类型的细胞释放到细胞外的环境中。最新报道显示,exosomes也含有mRNA和microRNA,它们也能够被运输到靶细胞,在靶细胞它们能够被翻译或者介导RNA的沉默。因而exosomes的囊泡可能是作为潜在的细胞间运输工具发挥着传递细胞间的信息传递及基因运输的功能,也在肿瘤侵袭转移过程中发挥了重要的作用。本研究旨在探讨人肠癌微环境中细胞成分之一的BM-MSCs是如何调控肠癌CSCs及影响肠癌细胞侵袭和转移的进程。研究方法:1、人骨髓来源的间充质干细胞对肠癌细胞的影响:(1)流式细胞术活细胞分选人骨髓间充质干细胞;(2)免疫荧光检测人骨髓间充质干细胞的E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,alpha-SMA的表达情况;(3)人骨髓来源的间充质干细胞与肠癌细胞系HCT-116、HT-29、SW-480分别共培养,观察在体外的两种细胞相互作用,观察肠癌细胞形态变化;(4)流式细胞术检测共培养后CD133-APC和Lgr5-PE在此三种细胞内的表达情况;(5)流式细胞术检测PI染色,观察三种细胞共培养后细胞周期的变化。2、人骨髓来源的间充质干细胞的条件培养基对肠癌细胞的影响:(1)培养人骨髓来源的间充质干细胞的培养基加入肠癌细胞系HCT-116、HT-29、SW-480分别共培养,观察在体外条件培养基对三种细胞的作用;(2)流式细胞术检测共培养后CD133-APC和Lgr5-PE在此三种细胞内的表达情况;(3)流式细胞术检测PI染色,分析三种细胞共培养后细胞周期的变化;(4)相差显微镜观察条件培养基对结肠癌细胞形态变化的影响。3、人骨髓来源的间充质干细胞的exosomes对肠癌细胞的影响:(1)人骨髓来源的间充质干细胞的培养基超速离心分离exosomes加入肠癌细胞系HCT-116、HT-29、SW-480分别培养,观察在体外人骨髓来源的间充质干细胞的exosomes对三种细胞的影响;(2)免疫电镜检测分离的exosomes的标志物CD81,CD63及Rab5A。(3)、流式细胞术检测加入exosomes培养后CD133-APC和Lgr5-PE在此三种细胞内的表达情况;(4)、流式细胞术检测PI染色,分析三种细胞加入exosomes后细胞周期的变化;(5)、相差显微镜观察加入exosomes后结肠癌细胞形态的变化;(6)、Transwell实验检测加入exosomes后结肠癌细胞侵袭能力的改变。4、exosomal microRNA-3120-5p对肠癌细胞的影响:(1)、分离exosomes进行芯片分析,比较与BM-MSCs共培养之后三种肠癌细胞的exosomes含有的microRNA的变化。生物信息学分析选定几个microRNA;(2)、分别转染microRNA进入肠癌细胞系HCT-116、HT-29、SW-480,观察几个microRNA对三种细胞形态的影响;(3)、相差显微镜观察转染microRNA后结肠癌细胞形态的变化;(4)、流式细胞术检测转染microRNA后CD133-APC和Lgr5-PE在此三种细胞内的表达情况;(5)、流式细胞术检测PI染色,分析三种细胞转染microRNA后细胞周期的变化;(6)、Transwell实验检测转染microRNA后结肠癌细胞侵袭能力的改变。5、microRNA-3120-5p通过下调靶基因影响肠癌干细胞的干性:(1)、microRNA靶基因芯片分析可下调的靶基因。生物信息学分析选定几个靶基因;(2)、分别合成含有几个靶基因的3’UTR序列的质粒,转染进入稳定表达microRNA-3120-5p的肠癌细胞系,TK质粒作为内参,确定microRNA的的靶基因;(3)、相差显微镜观察下调靶基因,siRNA转染后结肠癌细胞形态的变化;(4)、Real time PCR检测转染靶基因的shRNA和过表达后,相关的肿瘤干细胞基因在肠癌细胞内的表达情况;(5)、克隆形成实验及侵袭试验检测肠癌细胞的克隆形成及侵袭能力。6、肠癌CSCs的组织定位及与侵袭转移的关系:(1)、免疫荧光检测CD133与alpha-SMA在肠癌组织中的表达,确定肠癌CSCs的组织定位;(2)、免疫荧光检测80例临床样本中,肠癌CSCs的标志物CD133与Lgr5双阳性的细胞的表达;(3)、分析CD133与Lgr5双阳性的肠癌CSCs与临床病历中病人结肠转移癌的相关性。结果:1、人骨髓来源的间充质干细胞能够维持肠癌CSCs的表型并促进侵袭转移:(1)、人骨髓来源的间充质干细胞能够表达N-cadherin,不表达E-cadherin和Vimentin,表达alpha-SMA;(2)、人骨髓来源的间充质干细胞与肠癌细胞系HCT-116、HT-29、SW-480分别共培养,均能够形成明显的克隆球;(3)、共培养后肠癌CSCs表达的CD133和Lgr5的表达明显升高;(4)、共培养后三种肠癌细胞的细胞周期均明显下调;(5)、三种细胞共培养后,侵袭能力明显提高;(6)、三种细胞共培养后,细胞增殖能力明显降低。2、人骨髓来源的间充质干细胞的条件培养基能够维持肠癌CSCs的表型并促进侵袭转移:(1)、应用培养人骨髓来源的间充质干细胞的培养基培养肠癌细胞系HCT-116、HT-29、SW-480,均能够分别形成明显的克隆球;(2)、条件培养基处理后肠癌细胞表达的CD133和Lgr5的表达明显升高;(3)、条件培养基处理后,三种肠癌细胞的细胞周期均明显下调;(4)、条件培养基处理后,肠癌细胞的侵袭能力明显提高;(5)、条件培养基处理后,肠癌细胞的细胞增殖能力明显降低。3、人骨髓来源的间充质干细胞的exosomes能够促进肠癌CSCs的表型及侵袭转移:(1)、应用人骨髓来源的间充质干细胞exosomes处理肠癌细胞系HCT-116、HT-29、SW-480,均能够分别形成明显的克隆球:(2)、exosomes处理后肠癌细胞表达的CD133和Lgr5的表达明显升高;(3)、exosomes处理后,三种肠癌细胞的细胞周期均明显下调;(4)、exosomes处理后,肠癌细胞的侵袭能力明显提高;(5)、exosomes处理后,肠癌细胞的细胞增殖能力明显降低;(6)、exosomes处理后,MTT实验显示肠癌细胞明显耐药;(7)、去除exosomes后的条件培养基,不能促进肠癌细胞CD133和Lgr5的表达升高,也不能促进其Transwell实验通过的细胞数增加;(8)、裸鼠原位模型验证细胞实验结果。4、Exosomal microRNA-3120-5p能够促进肠癌CSCs的表型及侵袭转移:(1)、应用microRNA的芯片分析来源于BM-MSCs、肠癌细胞、共培养之后的上清中的exosomes,结果发现microRNA若干,这些microRNA在肠癌细胞exosomes中低表达的,而共培养之后会明显高表达。我们将它们上调的多少,进行生物信息学分析,分析结果归纳后,根据实验结果和已知的文献选择几个microRNA进行real time PCR系统的分析;(2)、经过系统的分析,合成转染microRNA-3120-5p,转染肠癌细胞,发现转染后microRNA-3120-5p能够使肠癌细胞系HCT-116、HT-29、SW-480,均能够分别形成明显的克隆球;(3)、microRNA-3120-5p能够促进肠癌细胞表达的CD133和Lgr5的表达;(4)、microRNA-3120-5p转染后,三种肠癌细胞的细胞周期均明显下调;(5)、microRNA-3120-5p转染后,肠癌细胞的侵袭能力明显提高。5、microRNA-3120-5p通过下调Axin2促进肠癌CSCs的表型及侵袭转移:我们应用microRNA的靶基因预测软件分析发现microRNA-3120-5p的若干靶基因,结合文献资料,选定Axin2为在肠癌细胞中主要发挥作用的靶基因。下调Axin2的表达分析肠癌干细胞干性及侵袭转移,结果显示与microRNA-3120-5p上调结果一致。6、肠癌CSCs主要定位于肿瘤间质,并且促进侵袭转移:(1)、免疫荧光结果显示,CD133与alpha-SMA细胞表达位子接近,但不共同表达,即没有共定位;(2)、在肠癌组织中,通过免疫荧光显示CD133和lgr5共同表达阳性的细胞数与肠癌的侵袭转移相关。结论:1、人BM-MSCs能够维持肠癌CSCs干性,促进肠癌细胞侵袭转移。2、BM-MSCs通过exosomes影响肠癌CSCs的干性及侵袭转移。3、Exosomes来源的microRNA-3120-5p在影响肠癌CSCs的干性方面发挥了重要的作用。4、肠癌干细胞主要定位于肿瘤间质与肿瘤来源的MSC比邻,其含量越多导致肠癌病人远端转移的情况越大,预后不良的发生几率也就越大。
【图文】：

人骨髓间充质干细胞,流式细胞术,分选,细胞

中国医科大学博士学位论文3 结果3.1 人骨髓来源的间充质干细胞分离及检测利用流式细胞术活细胞分选人骨髓间充质干细胞（图 1.1）待细胞长至 90%左右传代。可见细胞传至第六代与第代在细胞阳性 marker（CD44，CD105，CD90，，CD73）及阴性 marker（CD34，CD11b，CD19，CD45，HLA-DR）表达水平，无明显差别。即，它仍具备较好的干细胞性。

间充质干细胞,来源,肠癌

图 1.2 人骨髓来源的间充质干细胞 E-cadherin，N-cadherin，Vimentin，alpha-SMA 的表达。3.2 人骨髓来源的间充质干细胞能够促进肠癌 CSCs 的干性将人骨髓来源的间充质干细胞与三种肠癌细胞 HCT-116，HT-29 和 SW-480 共培养，比例为 1：1，人 BM-MSCs 培养于上层，而肠癌细胞接种于下层，培养 15天后，可见下层的肠癌细胞能够促进肠癌 CSCs 的克隆球形成，对照组的肠癌细胞密度再大也不会形成克隆球样结构。同样的，将人骨髓来源的间充质干细胞的条件培养基，即，培养人 BM-MSCs 细胞 1~2 天之间的培养基，处理肠癌细胞，每三天换次液。15 天后，可见人 BM-MSCs 细胞的条件基也能够促进肠癌 CSCs 的克隆球形成（图 1.3）。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.3

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