FOXL1和PP2A联合表达对胰腺癌PANC-1细胞增殖和转移的影响及调控机制的研究

发布时间：2020-05-10 14:27

【摘要】：前言:胰腺癌是一种较常见的恶性肿瘤,近年来发病率有显升高的趋势,病理类型大多为胰腺导管细胞腺癌,由于胰腺解剖位置深及肿瘤易发生早期转移和向周围侵袭,一旦确诊多属于晚期,预后及其不佳。尽管早期胰腺癌可行胰十二指肠切除术,但多数病人确诊时已不适合手术,5年中位生存率低于7%。即使结合化疗等综合治疗,治疗效果仍不理想。所以探索新的有效的靶点,研究致癌、促癌相关机制对治疗胰腺癌,改善其预后具有重大现实意义。FOXL1是插头蛋白/翼旋转盒子家族转录因子。包含FOXA到FOXR。FOX在许多生理或病理过程中起到了关键作用,比如成为肿瘤促进或抑制因子。特别是FOXM1被认为在胰腺癌中是肿瘤基因,且与预后不良有关。FOXL1最近被认为是胰腺癌抑制因子,与胰腺癌患者生存时间正相关。PP2A是一个大的寡聚蛋白质包括丝氨酸和苏氨酸磷酸酶,在真核细胞中占据了磷酸酶的多数。PP2A是关键的肿瘤抑制因子,通过控制一系列细胞生理过程负向调控多种对细胞增殖发挥关键作用的信号通路(MAPK/ERK、NF-kB和C-MYC通路)。PP2A抑制蛋白CIP2A,与胰腺癌患者生存时间负相关。PP2A通过抑制C-MYC蛋白62号位点丝氨酸磷酸化,诱导C-MYC泛素化降解进而抑制其肿瘤活性,延长肿瘤患者的生存时间。但二种抑癌基因同时转染肿瘤细胞对转染后肿瘤细胞生物学行为的影响,是否存在协同诱导细胞凋亡的作用尚未见报道,其机制也不清楚。目的:构建PANC-1细胞FOXL1和PP2A联合同时表达腺病毒模型,研究FOXL1和PP2A在PANC-1细胞转染后含量的动态变化;检验FOXL1和PP2A联合同时转染对PANC-1细胞增殖、迁移能力和凋亡的影响;检验FOXL1和PP2A联合同时转染后PANC-1细胞对5-Fu敏感性的变化;探索FOXL1和PP2A联合同时转染协同促进PANC-1细胞凋亡的机制。研究方法:使用腺病毒构建FOXL1和PP2A共表达载体,分为Ad(CON)、Ad(FOXL1)、Ad(PP2A)和Ad(FOXL1+PP2A)组。用免疫印记(Western blot)、实时荧光定量PCR(qPCR)检测四组细胞中FOXL1和PP2A表达,并检测下游蛋白TRAIL、MYC、CLEAVED-CASPASE3、Lyzed-PARP的表达。细胞计数实验检测四组细胞0、3、5、7天后细胞增殖情况,划痕实验检测四组细胞转移能力,使用流式细胞仪及CASPASE3荧光试剂盒检测四组细胞对5-Fu的敏感性。使用t检验、方差分析检测四组细胞经过不同处理的差异性。结果:Ad(FOXL1)组和Ad(FOXL1+PP2A)组PANC-1细胞转染后,FOXL1的mRNA和蛋白水平显著提高(P0.001,P0.001),Ad(PP2A)组与Ad(CON)比无显著差异,PP2A的mRNA和蛋白在Ad(PP2A)组和Ad(FOXL1+PP2A)组显著高于对照组(P0.001,P0.0001),Ad(FOXL1)组与Ad(CON)相比无显著差异。细胞计数实验显示转染腺病毒5或7天后,Ad(FOXL1+PP2A)组PANC-1细胞的生长速率与对照组相比降低(P0.05 for 5 D.P.I.,or P0.01 for 7 D.P.I.)。细胞克隆实验证明Ad(FOXL1)组,Ad(PP2A)组和Ad(FOXL1+PP2A)组形成较少的细胞群落(P0.05,P0.01 or P0.001),四组间细胞克隆大小存在显著差异(P0.01,P0.01,P0.01)。Ad(FOXL1)组,Ad(PP2A)组和Ad(FOXL1+PP2A)组中的克隆群落明显小于Ad(CON)组。转染3 MOI病毒后,Ad(FOXL1)组,Ad(PP2A)组和Ad(FOXL1+PP2A)组与Ad(CON)相比PANC-1细胞迁移显著减少(P0.01,P0.01,P0.001)。给予10μM 5-FU,检测Ad(CON)组,Ad(FOXL1)组,Ad(PP2A)组和Ad(FOXL1+PP2A)组PANC-1细胞对化疗药物敏感性,Ad(FOXL1)组,Ad(PP2A)组和Ad(FOXL1+PP2A)组细胞与Ad(CON)相比存活率明显下降(P0.05,P0.01,P0.05)。Ad(FOXL1)组,Ad(PP2A)组和Ad(FOXL1+PP2A)组较Ad(CON)组CLAVED-CASPASE3表达升高(P0.05;P0.05;P0.001),CASPASE3活性升高(P0.05,P0.01 or P0.001)。在PANC-1细胞中,转染3 MOI Ad(FOXL1)组和Ad(FOXL1+PP2A)组,TRAIL的mRNA水平显著上调(P0.01,P0.01),转染Ad(CON)组和Ad(PP2A)组,无显著差异。MYC的m RNA水平经上述病毒转染各组均无明显差异。转染3 MOI Ad(FOXL1)组和Ad(FOXL1+PP2A)组TRAIL的蛋白水平明显上升(P0.01,P0.01),各组中MYC的蛋白水平无明显差异。转染Ad(PP2A)组和Ad(FOXL1+PP2A)组,MYC磷酸化(S62)水平受到显著抑制(P0.05)。结论:1、成功构建PANC-1细胞FOXL1和PP2A联合过表达模型,PANC-1细胞内FOXL1和PP2A表达明显增高。2、FOXL1和PP2A联合同时转染协同抑制胰腺导管癌细胞PANC-1增殖和迁移。3、FOXL1和PP2A联合同时转染提高PANC-1细胞对5-Fu的敏感性,增加细胞凋亡。4、FOXL1和PP2A联合同时转染通过增加TRAIL蛋白表达,抑制p-MYC(S62)表达协同叠加促进细胞凋亡。
【图文】：

8图 1A FOXL1 和 PP2A 联合同时表达的“2A”自切序列腺病毒示意图。FOXL1 和 PP2A DNA 片段连接于腺病毒 DNA 中，共同转录形成 FOXL1-2A -PP2A mRNA后参与转录后翻译，并在蛋白水平分裂成连个蛋白，形成同时表达两个蛋白的效果。FOXL1 和 PP2A 序列通过 2A”自切序列连接，利用 PCR 技术，从合成的模板质粒中提取目的基因，通过双酶切，连接到 pShuttle-CMV 重组穿梭载体中后，形成病毒(PCMV)，转染宿主细胞后可以在蛋白水平上实现 FOXL1、PP2A、FOXL 1+PP2A 的高表达。注：Ad (CON) ( EGFP 过表达)、Ad (FOXL1) ( FOXL1 过表达)、Ad (PP2A) ( PP2A 过表达)和Ad (FOXL1+PP2A) (FOXL1 和 PP2A 联合过表达)。

1B 在 PANC-1 细胞中，Ad(CON)中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在 1MOI 转染后的表达情况。EGFP 表达用于评估 PANC-1 细胞中 Ad (FOXL1)、Ad (PP2A) or Ad (FOXL1 +PP2A)病毒转后蛋白表达的效率。倒置荧光显微镜观察显示 Ad (CON) 病毒转染后 85% PANC-1 细胞 EGFP达增高，绿色明显，，该腺病毒转染效率符合实验标准。Ad (CON) ( EGFP 过表达)，Ad (FOXL1)FOXL1 过表达组)，Ad (PP2A) ( PP2A 过表达组)和 Ad (FOXL1+PP2A) (FOXL1 和 PP2A 联合表达组)可以有效转染入胰腺导管上皮肿瘤细胞 PANC-1 中。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9

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本文编号：2657444