miR-92b-3p通过靶向FBXW7促进结直肠癌恶性行为的机制研究

发布时间：2020-05-13 05:59

【摘要】：目的:结直肠癌是最常见的癌症类型之一,其发病率占恶性肿瘤总数的9%,并且有每年增加的趋势。miRNA在哺乳动物体内广泛存在,参与到细胞生长、分化、凋亡等多个过程,目前对其的研究很多,可以作为肿瘤潜在的诊断和治疗靶点,已有多项研究探讨miRNA和结直肠癌及其基因的分子机制,已知miR-92b-3p在结直肠癌细胞和组织中都有异常高水平的表达,但是miR-92b-3p与结直肠癌的关系,以及在其中的作用机制报道很少。方法:第一部分:1.利用CCK8实验检测mi R-92b-3p inhibitor处理结直肠癌细胞系HCT116和HT29细胞增殖能力以及克隆形成能力的变化;2.miR-92b-3p inhibitor处理的各组细胞,利用流式细胞术检测各组细胞细胞周期比例变化,以及各组细胞凋亡水平的变化;3.mi R-92b-3p inhibitor处理结直肠癌细胞后,采用transwell方法对细胞的迁移和侵袭能力进行检测。第二部分:1.利用生物信息学技术和公共数据库miRBase和TargetScan进行miRNA序列匹配,预测miR-92b-3p的作用靶标基因;2.利用双荧光素酶报告实验对miR-92b-3p及其作用靶标基因FBXW7的相互作用关系进行验证;3.设计并构建过表达FBXW7的pcDNA3.0载体,转染细胞后,通过CCK8实验检测FBXW7过表达对结直肠癌细胞系HCT116和HT29细胞增殖以及克隆形成能力的影响;4.在结直肠癌细胞系中过表达FBXW7,利用流式细胞术检测各组细胞细胞周期比例以及凋亡水平的变化;5.在结直肠癌细胞中过表达FBXW7后,利用Transwell实验对细胞的迁移和侵袭能力改变进行检测。第三部分:1.建立细胞实验组:blank组、inhibitor组、inhibitor+siFBXW7组和NC组,进行下游功能实验;利用CCK8实验检测miR-92b-3p和FBXW7对结直肠癌细胞系HCT116和HT29细胞增殖能力以及克隆形成能力的影响;2.流式细胞术检测四组细胞细胞周期和凋亡情况细胞改变;3.transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力的改变;第四部分:建立了移植瘤裸鼠实验模型,记录裸鼠体内肿瘤大小,绘制生长曲线,HE染色鉴定肿瘤组织病理学特征;结果:第一部分:1.相对于正常结直肠组织细胞,miR-92b-3p在结直肠癌细胞系HCT116和HT29中表达水平异常增高,抑制miR-92b-3p对结直肠癌细胞生长和克隆形成能力有显著抑制作用(p0.05);2.抑制miR-92b-3p对结直肠癌细胞的细胞周期具有阻遏作用,更高比例的细胞被阻遏在了G0/G1期,S期细胞比例减少(p0.05);抑制mi R-92b-3p提高了结直肠癌细胞的凋亡水平;3.抑制miR-92b-3p对结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力具有阻遏作用(p0.05)。第二部分:1.信息学预测认为FBXW7是miR-92b-3p的直接作用靶标基因之一,双荧光素酶报告基因实验证明了二者的直接作用关系;2.在HCT116和HT29两株结直肠癌细胞系中过表达FBXW7,过表达组癌细胞的增殖和克隆形成能力明显低于对照组(p0.05);3.在HCT116和HT29两株结直肠癌细胞系中过表达FBXW7,相对于对照组,实验组细胞周期明显被阻遏于G0/G1期,同时S期细胞比例下降(p0.05);而相对应的癌细胞的凋亡水平有明显上升(p0.05);4.在HCT116和HT29两株结直肠癌细胞系中过表达FBXW7,相对于对照组细胞,实验组癌细胞的迁移和侵袭能力被显著抑制(p0.05)。第三部分:1.经过miR-92b-3p inhibitor处理后,相对于对照组细胞,实验组细胞增殖和克隆形成能力有了明显被抑制,而inhibitor+siFBXW7处理组细胞的增殖和克隆能力有了部分恢复(p0.05);2.在细胞周期与凋亡实验中,相对于对照组,通过miR-92b-3p inhibitor处理的细胞系细胞周期能力有了明显被抑制在G0/G1的趋势,S期细胞比例下降,进入凋亡的细胞比例明显上升。而inhibitor+siFBXW7处理组细胞的周期和凋亡水平都有了部分恢复(p0.05);3.在transwell实验中,miR-92b-3p inhibitor处理后细胞其迁移和侵袭能力明显被抑制,inhibitor+siFBXW7处理组细胞的迁移和侵袭能力有了部分恢复(p0.05);第四部分:1.在裸鼠成瘤实验中,发现mi R-92b-3p inhibitor组的裸鼠瘤体大小明显比对照组裸鼠瘤体更小,而inhibitor+siFBXW7组抵消了瘤体缩小的效果,裸鼠瘤体有所恢复。2.组织病理学切片进行镜下观察时,发现相对于对照组,miR-92b-3p inhibitor组的肿瘤组织结构被明显抑制,而inhibitor+siFBXW7组的癌组织得到了很大程度的恢复。结论:在结直肠癌中高水平的表达的mi R-92b-3p能够靶向性抑制FBXW7表达水平,导致癌细胞获得更高的增殖能力和抗凋亡能力。低水平的miR-92b-3p能够抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力并诱导其细胞发生凋亡,这可能是由于FBXW7表达水平得到升高而引起的;这是第一次关于在结直肠癌中miR-92b-3p与FBXW7相互作用并影响癌细胞生物学功能的报道,相关结果在裸鼠体内实验也得到了证明,揭示mi R-92b-3p具有原癌基因功能的分子机制。
【图文】：

结直肠癌,细胞株,表达水平

15 进行统计学分析，两组数据间比较采用 t 检验、多t-hoc 分析，两组以上数据间比较采用 One-Way ANOV显著差异。-3p 在结直肠癌组织与细胞系中的表达及意义肠癌细胞株 HT29，HCT116 以及 FHC 人正常结直肠胞内 miR-92b-3p 表达水平进行 RT-PCR 分析，发现系 HT29、HCT116 和人正常结直肠粘膜细胞 FHC 中和 HCT116 这两个结直肠癌细胞株中，miR-92b-3p 的图 1.1)。

克隆形成,细胞克隆,细胞的,结直肠癌

重庆医科大学博士研究生学位论文2.2 敲减 miR-92b-3p 抑制 HT29 和 HCT116 细胞增殖能力为了观察 miR-92b-3p 是否影响到结直肠癌细胞株 HT29 和 HCT116 的生物学行为和功能，我们分别在结直肠癌细胞系 HT29、HCT116 中利用 miR-92b-3pinhibitor 处理,比较处理前后的细胞增殖和克隆形成能力，发现处理组的 HT29、HCT116 细胞增殖和克隆形成能力明显降低，，明显低于未处理组，差异具有统计学意义（图 1.2）。该结果提示敲减 miR-92-3p 能够抑制结直肠癌细胞 HT29 和HCT116 的克隆形成能力。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

【参考文献】