髓系肿瘤骨髓间充质干细胞生物学和遗传学特性的初步研究

发布时间：2020-05-15 03:17

【摘要】：目的:通过研究急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)和慢性髓细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)等髓系肿瘤骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的生物学和遗传学特性的改变,探讨髓系肿瘤骨髓微环境(bone marrow microenvironment,BMM)的变化。方法:(1)MSC的分离和鉴定:首先采用Ficoll淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞(mononuclear cells,MNC),然后采用贴壁法去除悬浮细胞,留下贴壁细胞。采用流式细胞术、诱导分化实验和集落形成实验对分离的MSC进行鉴定;(2)MSC生物学特性分析:CCK8法、集落形成实验检测MSC的增殖能力,衰老β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法检测MSC的衰老细胞比例,长期共培养起始细胞(long-term culture-initiating cell,LTC-IC)实验检测MSC的造血支持能力;(3)MSC遗传学分析:应用常规核型分析(conventional cytogenetic analysis,CCA)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术检测骨髓造血细胞(hematopoietic cells,HC)和MSC的细胞遗传学,MDS患者骨髓FISH检测采用MDS组套探针,CML患者采用bcr-abl双色双融合探针;NGS技术检测AML患者与MDS患者骨髓HC和MSC的热点基因突变。结果:1.MSC的分离与鉴定:取第3代分离的贴壁细胞进行鉴定。(1)经流式细胞术检测,该贴壁细胞不表达HC的标志抗原,如CD45和CD34;表达CD44、CD73、CD90和CD105。(2)诱导分化实验表明贴壁细胞可向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化,说明该贴壁细胞具有多向分化的潜能。(3)集落形成实验表明,单个贴壁细胞能够增殖形成经染色后肉眼可见的克隆单位,说明该贴壁细胞具有自我更新的干细胞特性。上述鉴定结果均符合国际治疗学会(international Society for Cellular Therapy,ISCT)制定的鉴定MSC的最低标准,因此可以认为所分离纯化的贴壁细胞为MSC。2.MSC的生物学特性:髓系肿瘤组(AML、MDS或CML患者)与健康供者(healthy donor,HD)对照组骨髓MSC在增殖能力、衰老细胞比例以及造血支持能力等三方面存在的差异。CCK8法检测结果显示:从第3-4d开始,髓系肿瘤组的增殖速度显著低于对照组;但髓系肿瘤组内无明显差异。同样,集落形成实验也表明,较HD组,髓系肿瘤组的增殖能力显著降低,但各肿瘤组内无明显差异。HD、AML、MDS和CML的集落形成个数分别为:13.55±2.73、9.73±2.53、7.75±1.91与7.60±3.06。SA-β-Gal染色实验结果为:第8代AML、MDS和CML骨髓MSC的衰老细胞占比分别为56.38±6.23%、53.75±14.66%和60.17±6.52%,显著高于HD组的衰老细胞占比(23.14±4.18%)。可见,髓系肿瘤骨髓MSC较HD-MSC更容易衰老。将骨髓MSC与HD骨髓CD34~+HSC长期共培养,通过计数起始细胞数来评估MSC的造血支持能力。相比于对照组,与髓系肿瘤组MSC长期共培养后的HD骨髓CD34~+HSC所形成的集落个数明显减少。髓系肿瘤组的起始细胞数(CFU-GM、CFU-E和BFU-E集落个数总和)约为HD组的1/3,说明髓系肿瘤组MSC造血支持能力受损,但组内无明显差异。3.MSC的遗传学特征:分析AML、MDS和CML患者骨髓MSC和HC的细胞遗传学及热点基因的突变情况以探究髓系肿瘤MSC与HC遗传学特性及其关系。行CCA检测29例AML患者骨髓HC和MSC的细胞核型,其中骨髓HC检出异常核型的患者有16例,但在骨髓MSC中均未检出细胞遗传学异常。联合CCA和FISH检测37例MDS患者和15例CML患者骨髓MSC与HC的特异性位点的染色体异常。34例MDS患者骨髓HC培养成功、有分裂相,其中16例检出核型异常;但骨髓MSC的细胞核型均未检出异常;10例MDS患者骨髓HC经FISH检出5q-、7q-和+8等位点的改变,但其骨髓MSC的检测结果也均为阴性。CML患者骨髓HC均检出费城染色体和bcr-abl融合基因,但骨髓MSC均未检出。采用二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术进一步检测AML和MDS骨髓HC和MSC热点基因,发现送检标本的HC均检出若干个基因突变,但是,仅有1例AML患者的MSC样本检出AXSL1基因突变。结论:密度梯度离心法联合贴壁法分离MSC方法可靠,所提取的MSC具有干细胞特性,符合ISCT制定的定义MSC的最小鉴定标准。髓系肿瘤患者骨髓MSC生物学功能受损,表现为MSC增殖能力、自我更新能力和造血支持功能均减弱,具有明显衰老倾向。遗传学特征在髓系肿瘤患者骨髓MSC与骨髓HC之间无相关性。
【图文】：

结 果细胞鉴定该部分研究所采用的细胞来自 HD 骨髓。原代细胞培养时，悬浮与贴壁，经过第 1 代和第 2 代的纯化培养，直至第 3 代，悬浮细胞已完全去除壁生长的梭形细胞可用于细胞鉴定。 细胞表面标志物鉴定采用流式细胞术检测细胞表面标志物，结果显示：贴壁细胞均不表达 HC原，如 CD34 和 CD45；表达 CD44、CD73、CD90 和 CD105，阳性率均，符合 ISCT 制定的鉴定 MSC 的最低标准[19]。图 1 展示的是 HD（N2，者 2 号）骨髓贴壁细胞的检测结果：CD34 和 CD45 的阳性表达为 0.9%和 044、CD73、CD90 和 CD105 的阳性率分别为 99.8%、99.7%、99.2%和 99

2 多向分化能力鉴定对贴壁细胞行成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞诱导分化培养。其形态从纤胞样的贴壁细胞分别逐渐分化成三种细胞形态：①成骨细胞诱导分化培养实，，细胞分化成富含钙结节的成骨细胞（图 2a），其钙质沉淀经茜素红媒染后红色（图 2g）；②成脂肪细胞诱导分化培养实验中，细胞分化成聚集脂质空脂肪细胞（图 2b），中性脂肪滴经油红 O 染为橘红色，胞质经苏木素复染为（图 2h）；③成软骨细胞诱导分化培养实验中，细胞分化成多角形的软骨细图 2c），其软骨形成基质经阿利新蓝染料染为蓝色，而胞核不着色（图 2i）照组的细胞染色后未见阳性细胞（图 2 d-f）。该部分实验结果表明本项目所的方法分离出的贴壁细胞具有多向分化的干细胞特性。成骨分化 成脂分化 成软骨分化分化已
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733;R730.43

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本文编号：2664388