过表达Twist1促进结直肠癌细胞SW620获得多药耐药性的研究

发布时间：2020-05-16 19:56

【摘要】：目的:探讨过表达Twist1是否促进结直肠癌SW620细胞多药耐药性(MDR)的获得,并对其作用机制进行初步研究。方法:利用过表达Twist1的慢病毒载体Twist1-GFP-LV及阴性对照病毒NC-GFP-LV转染SW620细胞,分别称为实验组(SW620/Twist1)和对照组(SW620-NC),对两组细胞作以下检测:(1)确定过表达效果:(1)RT-qPCR检测Twist1 m RNA相对表达量;(2)Western blot检测Twist1蛋白表达;(2)细胞对化疗药物奥沙利铂及5-FU的耐药性通过CCK8法检测:首先检测两种药物对SW620细胞的半数抑制浓度(IC50),用该浓度的药物分别作用于两组细胞,在加药后24h、48h及72h,检测细胞增殖抑制率的差异;(3)耐药指标检测:(1)ABCB1、ABCG2 mRNA相对表达通过RT-qPCR检测,(2)ABCB1(P-gp)、ABCG2(BCRP)蛋白表达通过Western blot检测;(4)肿瘤干细胞标志物检测:CD133、CD44表达通过流式直标抗体技术检测。结果:(1)过表达效果测定:(1)RT-q PCR检测Twist1 mRNA相对表达结果为:实验组对照组中Twist1 m RNA相对表达值为(2.54±0.31)及(0.97±0.33),实验组较对照组增高约2.6倍(P0.01),(2)Western blot检测Twist1蛋白表达值在实验组和对照组中分别为(1.12±0.03)及(0.53±0.02),实验组显著增高(P0.01),提示Twist1过表达效果满意,细胞建模成功。(2)奥沙利铂与5-FU对SW620细胞的IC50分别为14.33ug/ml和41.62ug/ml,分别采用IC50浓度的奥沙利铂和5-FU作用于实验组和对照组,检测两组细胞三个时间点(24h、48h、72h)时的增殖抑制率。结果提示与对照组对比,实验组中两种化疗药物在不同时间点对细胞增殖抑制率均下降,但24h时差异不明显(P0.05)、48h、72h时抑制率均显著降低(48h,P0.05;72h,P0.01)。以上结果表明过表达Twist1后细胞对两种化疗药物均产生耐药,呈现出MDR特性;(3)耐药基因及蛋白检测:(1)RT-qPCR检测实验组和对照组中ABCB1(P-gp)mRNA、ABCG2(BRCP)mRNA相对表达量分别为(2.0.2±0.12)及(0.94±0.23)、(2.45±0.38)及(0.91±0.22),与对照组比较,实验组中两种基因mRNA相对表达均增高(P0.01);(2)Western blot检测实验组和对照组中ABCB1(P-gp)蛋白表达量为(0.70±0.03)及(0.35±0.05),ABCG2(BCRP)蛋白表达量为(0.75±0.12)及(0.29±0.08),对比对照组,实验组中两种蛋白表达明显提高(P0.01)。(4)肿瘤干细胞标志物检测:流式直标抗体检测两组细胞CD133的阳性率分别为(54.3±2.6)%及(78.6±3.8)%;CD44的阳性率分别为(5.6±1.2)%及(12.5±2.0)%,过表达Twist1后,肿瘤干细胞标志物CD133及CD44表达均显著增高(P0.01)。结论:过表达Twist1可促进直肠癌SW620细胞耐药指标ABCB1(P-gp)、ABCG2(BRCP)表达,使肿瘤细胞获得MDR,该现象可能与Twist1高表达提高SW620细胞干细胞标志物表达、促进干性获得有关。
【图文】：

转染,图片,病毒组,过表达

- 22 -转染过表达病毒组，明视野（100×）转染过表达病毒组，荧光视野（100×）图1 SW620转染图片Fig1. The image of formal transfection in SW6202.2 RT-qPCR检测实验组、对照组Twist1 mRNA相对表达以GAPDH为内参，采用RT-qPCR检测两组细胞中Twist1 mRNA相对表达水平。结果显示SW620/Twist1与SW620-NC两组Twist1 mRNA相对表达水平分别为（2.54±0.31）及（0.97±0.33）。与对照组对比，，实验组Twist1 mRNA相对表达显著增高（P＜0.01）（见图2）。

表达水平,细胞,对照组,内参

检测两组细胞Twist1 mRNA表达水平；与SW620-NC组比较，vels of Twist1 detected by RT-qPCR. Compared with SW620-NC, lot检测实验组、对照组Twist1蛋白表达为内参，western blot检测实验组与对照组Twist1蛋白表3）及（0.53±0.02）。与对照组相比，实验组Twist1蛋见图3）。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

【参考文献】