基于噬菌体展示技术的亲和多肽筛选及其在肿瘤识别中的应用

发布时间：2020-05-17 14:25

【摘要】：噬菌体展示技术是一种功能强大的分子文库展示技术,可针对特定的靶标有效地筛选出特异性的多肽或蛋白分子。由于多肽分子具有分子量小、易合成修饰、生物免疫原性低等优点,因此多肽作为一种生物识别分子被广泛应用于生物医学领域。常见的生物识别分子,如抗体虽然亲和力高、特异性好,但分子量大、提取方法复杂,核酸适体虽然灵活性高,但其二级结构和结合效果易受周围环境的影响,因此多肽作为生物识别分子具有独特的优势。目前肿瘤相关问题是人们关注的热点,肿瘤标志物作为一种与肿瘤的发生密切相关的生物标志物,常用于肿瘤的诊断、监测和预后,因此以肿瘤标志物为靶标筛选出特异性的多肽识别分子具有重要意义。传统的噬菌体展示技术主要是将靶标固定在固相载体上,经过多轮淘选以获得具有结合能力的噬菌体克隆,虽然该技术能有效地筛选出具有特异性亲和能力的多肽,但是筛选过程中存在文库易偏向性扩增、易交叉污染、单克隆的挑取和验证步骤繁琐等问题,因此如何发展出快速、高效、简单的筛选新方法是目前噬菌体展示技术亟待解决的一个重要问题。本论文以发展噬菌体展示技术新方法及其应用为研究目标,结合微流控技术,建立快速、高效、高通量、自动化的噬菌体展示技术新平台。本工作主要展开了以下两个工作:(1)利用传统的噬菌体展示技术以肿瘤标志物为靶标进行筛选,并筛选得到了对应的特异性结合多肽。分别针对蛋白CD71和c-Met筛选得到了具有特异性的识别多肽,并模拟了其二级结构,为了考察这些多肽分子的结合能力,对其结合能力、特异性以及对肿瘤细胞的识别能力进行了分析。(2)结合微流控芯片试剂消耗量少、通量高、易集成等优势,建立了基于液滴微流控噬菌体展示技术新方法。根据微流控相关理论,设计了一种具有螺旋结构的双入口十字交叉芯片,用于液滴的生成。以CD71为靶标,先在芯片外对噬菌体文库进行预富集,再对预富集的文库实现芯片上的筛选。利用微流控液滴生成技术,将单个分散的噬菌体和包被了靶标的微球一起包裹到微液滴中,利用液滴中的宿主菌对噬菌体进行大量扩增实现信号放大,当融合噬菌体与靶标具有结合能力时噬菌体可以结合到微球表面,最后破乳收集微球并对噬菌体核酸染色,荧光显微镜下挑取微球直接获得具有结合能力的单克隆。通过该方法最后获得了具有特异性结合能力的多肽,并进一步对这些多肽的结合能力进行了分析考察。这种筛选新方法具有液滴生成快速、通量高、试剂消耗少的优点,还降低了交叉污染的风险,提高了筛选效率。
【图文】：

蛋白质外壳和环状申链ＤＮＡ组成，全基因组共有１１个基因，其中５个基因编逡逑码衣壳蛋白，分别是ｐ３、ｐ６、ｐ７、ｐ８和ｐ９蛋白，基于这些衣壳蛋白位点可以构逡逑建多种外源多肽或蛋白展示的方法［３３］，如

图１．３噬菌体介导的裸眼定量检测［４３］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｐｈａｇｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｃｏｕｎｔｉｎｇ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ邋ｂｙ邋ｎａｋｅ邋ｅｙｅ［４３］逡逑噬菌体的尺寸在纳米级别，而且形状大小均一，使其在一些基于材料的牛物逡逑传感器方面也有较好的应川。Ｓｃｕｎｇ－Ｗｕｋ邋Ｌｅｅ课题组［４４］从火鸡皮肤颜色的变化获逡逑得灵感，模拟火鸡皮肤内胶原束纳米结构，发展了基于噬菌体自组装［４５］的纳米逡逑结构牛物传感器，该传感器可以检测湿度变化和挥发性有机物质，并进一步利；］］逡逑噬菌体可展示外多肽的性质实现了邋ＴＮＴ等分子的灵敏检测。通过在噬菌体衣壳逡逑蛋白融合表达ＴＮＴ特异性结合多肽，使噬菌体纳米传感器可以特异性识别ＴＮＴ，，逡逑ＴＮＴ与噬菌体表面多肽的结合会导致噬菌体纳米束的迅速膨胀或收缩，由于光逡逑的相干散射原理，传感器发生明显的颜色变化，由此轻松实现靶分子的快速灵敏逡逑检测。这种基于噬菌体展示的牛物传感器能特异性识别Ｋ分ＴＮＴ和它的类似物，逡逑检测灵敏度低至３００邋ｐｐｂ．的ＴＮＴ，具有高灵敏度和高特异性识别能力，这种快速、逡逑
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.4

【参考文献】

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1 Xiaohua Guo;Chuncheng Niu;Yunhua Wu;Xiaosheng Liang;;Application of an M13 bacteriophage displaying tyrosine on the surface for detection of Fe~(3+) and Fe~(2+) ions[J];Virologica Sinica;2015年06期

本文编号：2668697