非小细胞肺癌miR-191启动子甲基化位点研究及临床特征分析

发布时间：2020-05-17 14:29

【摘要】：目的:探讨miR-191启动子甲基化状态,及miR-191启动子甲基化状态作为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)预后分析等检测指标的可能性。方法:通过生物信息学网站对miR-191启动子区甲基化状态预测,并从TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库下载484例LUAD(lung adenocarcinoma,肺腺癌)以及397例LUSC(Lung squamous cell carcinoma,肺鳞癌)患者的甲基化芯片数据(Illumina Human Methylation 450 lvl-3)和相应临床信息,分析位于mi R-191启动子区甲基化状态是否有差异性,并比较低甲基化组与高甲基化组间年龄、性别、TNM分期、预后等的差异。收集128例NSCLC术后组织和对应癌旁组织,选择最具有特异性的甲基化位点设计引物,用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)检测NSCLC和癌旁组织中mi R-191启动子甲基化水平,并分析miR-191启动子甲基化水平与性别、年龄、分化程度、TNM分期、组织类型、预后等之间的关系。结果:生物信息学结果显示miR-191启动子区存在CpG岛。分析TCGA数据库的芯片数据发现,在LUAD及LUSC中,miR-191启动子区cg17217654位点甲基化水平显著低于正常肺组织(P0.001),并且miR-191启动子甲基化水平与患者的TNM分期相关,分期较晚的患者甲基化水平更低(P=0.025),生存分析显示在LUAD组及LUSC组中mi R-191启动子低甲基化水平的患者总生存期(P=0.0116)更短。根据cg17217654位点所设计的引物可以扩增出特异性的条带,扩大样本至128例后发现128例NSCLC标本中有57例发生甲基化,甲基化率为44.5%,128例正常肺组织标本中有105例发生甲基化,甲基化率为82.0%。肺癌组织和正常肺组织间miR-191启动子甲基化率进行统计学分析,组间差异有统计学意义(χ~2=38.733,P=0.000),其甲基化水平与组织分化程度、患者TNM分期相关(P0.05),而与性别、年龄、组织类型等无明显相关性(P0.05),生存分析显示mi R-191启动子低甲基化水平的患者总生存期更短(P=0.0139)。结论:miR-191启动子的甲基化在NSCLC发生发展中扮演着至关重要的角色,其中,肺癌组织中mi R-191启动子区的甲基化水平显著低于癌旁组织,且低甲基化水平的患者TNM分期更晚、总生存期更短。MSP结果显示,肺癌组织的甲基化率显著低于癌旁组织,非甲基化患者的组织分化程度更低、TNM分期更晚;相较于甲基化组患者,非甲基化组的患者总生存期更短。本次研究成功筛选出特异性的甲基化位点并验证,且该位点的甲基化与患者的TNM分期以及预后相关。这些结果表明,miR-191启动子的甲基化异常可能参与了NSCLC的发生发展过程。
【图文】：

磁珠,甲基化,碱基,位点

其中包含了 27k 平台的 90%位点，并且同时能保证单碱基的精度。40k 平台采用了 Infinium I（InfI）和 Infinium II（InfII）两种化学检测法，者占 28.1%（n=135501 个），后者占 71.9%（n=350076 个）[23,24]。InfI 使了两个探针来检测单个甲基化位点：一个甲基化的（methylated）M 型磁和一个未甲基化的（unmethylated）U 型磁珠。DNA 在经过重亚硫酸盐转之后，发生了甲基化的胞嘧啶仍然是 C 碱基，而没有发生甲基化的胞嘧则变成了 T 碱基。用来检测甲基化位点的 M 型磁珠探针的 3’末端为 G 碱，而 U 型磁珠 3’末端为 A 碱基，用以检测未甲基化位点。当 DNA 的胞啶发生甲基化时，可与 M 磁珠配对，荧光标记的核苷酸掺入后延伸，可检测到荧光信号，此时 M 磁珠发光。如果 DNA 胞嘧啶没有被甲基化，与 U 磁珠配对，延伸后 U 磁珠发光。

启动子区,位点,甲基化,探针

图 1.1 miR-191 启动子区 CpG 岛的预测及各 CpG 位点阴影部分为 CpG 岛Fig 1.1 Prediction of CpG islands in miR-191 promoter region and CpG sitesThe shadow area is CpG Island2.2 miR-191 及各甲基化芯片探针位点miR-191 启动子区共有 15 个甲基化芯片探针位点，去除 2 个数据有缺失的位点，，将各甲基化探针位点标注在下图中（附录 1）。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

【参考文献】