间断温和负压对MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞生物学特性的影响

发布时间：2020-05-17 14:50

【摘要】：研究背景:随着乳腺癌治疗理念的更新及患者需求的不断提高,乳腺癌术后的乳房再造地位已经逐步提升至乳腺癌诊疗环节的一部分,相关再造术式得到充分开发应用。自体脂肪移植用于乳房再造具有生物相容性好、微创化且便于护理等优势,广受青睐。作为其重要的辅助方法,体外负压扩张装置在乳房再造中使用并优化了脂肪移植乳房再造的临床效果。近年来脂肪移植技术广泛应用于乳房再造,其肿瘤安全性受到肿瘤与整形界广泛关注。2009年,美国整形外科医师协会发表观点:目前证据暂无法支撑脂肪移植促进乳腺癌进程的推论,暂可认为脂肪移植是一种安全可靠的乳房再造方法。作为其重要辅助方法,体外负压扩张装置的使用是否会影响乳腺癌进展?解答这一问题,对在乳房再造领域推广该技术至关重要。研究目的:1、建立仿临床作用模式的体外负压乳腺癌细胞培养模型及动物种植瘤原位负压吸引模型;2、通过体外及体内模型,比较研究间断温和负压环境及常压环境对三阴性乳腺癌生物学特性的影响:(1)比较间断温和负压环境及常压环境对三阴性乳腺癌侵袭力的影响;(2)比较间断温和负压环境及常压环境对三阴性乳腺癌增殖的影响;(3)比较间断温和负压环境及常压环境对三阴性乳腺癌死亡的影响。研究方法:1、体外负压乳腺癌细胞培养模型及动物种植瘤原位负压吸引模型的建立(1)体外负压细胞培养装置:将聚丙烯材质密闭箱改良为可调控入气量的细胞培养装置并连接一抽气装置后放置于培养箱内。工作时,通过调节箱内进出气量达到平衡,形成稳定-25 mmHg负压;非工作时,释放入气口阀门,使装置与培养箱整体环境联通。转换周期为12小时。-25 mmHg组置于其中培养;0 mmHg组置于常压下培养。(2)动物局部负压作用皮下种植瘤模型:将0.15ml MDA-MB-231细胞悬液种植于两侧鼠背,一侧为对照组,常压条件下生长;另一侧为负压组,间断温和负压干预下生长,每日干预时间为3小时。2、间断温和负压环境及常压环境对三阴性乳腺癌生物学特性影响的比较研究(1)对三阴性乳腺癌细胞侵袭的比较研究:体外及体内实验建模成功后,Transwell侵袭实验及酶联免疫吸附试验用于观察负压条件下细胞侵袭力的变化及IL-8分泌变化;同时,在注射MDA-MB-231细胞悬液14天及28天时用免疫组织化学染色、实时PCR及Western blot检测负压干预下肿瘤血管密度、上皮间质化程度及炎性情况。(2)对三阴性乳腺癌细胞增殖的比较研究:建模成功后,CCK-8实验连续动态检测MDA-MB-231细胞体外增殖情况,酶联免疫吸附实验检测IL-6分泌情况;同时,在注射MDA-MB-231细胞悬液第28天用免疫组化检测实时乏氧细胞分布,第14天及28天用Western blot明确血管数目,注射后第1天、7天、14天、21天及28天动态观察瘤体单位面积荧光信号强度。(3)对三阴性乳腺癌细胞死亡的比较研究:建模成功后,Muse仪AnnexinV试验检测MDA-MB-231细胞体外凋亡情况,酶联免疫吸附实验检测TNF-α分泌情况;同时,在注射MDA-MB-231细胞悬液第14天及28天HE染色及TUNEL染色组织切片观察瘤体内死细胞分布及数目。研究结果:1、间断温和负压环境增加MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞侵袭力体外间断温和负压条件下培养的MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞,侵袭能力强于常压培养下同类细胞(p0.05),且IL-8分泌量多于常压下培养的MDA-MB-231 细胞(p0.05)。动物实验第14天获取的负压组MDA-MB-231肿瘤标本在基因及蛋白表达层面较对照组呈现出更明显的上皮间质化倾向;第14天及第28天获取的负压组MDA-MB-231肿瘤标本血管密度均大于对照组标本(p0.05)。2、间断温和负压环境对MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞增殖无显著影响体外间断温和负压条件下培养的MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞增殖力与常压培养下同类细胞差别不显著(p0.05),但IL-6分泌量多于常压下培养的MDA-MB-231 细胞(p0.05)。动物实验第14天获取负压组标本的皮肤及皮下组织浅层乏氧细胞较常压组多,但瘤体内部乏氧细胞差异不显著;第14天及第28天获取的负压组MDA-MB-231肿瘤标本CD31蛋白表达量大于对照组标本(p0.05),但Ki67阳性细胞百分比两组差异不显著(p0.05)。活体荧光成像各时段两组荧光信号强度变化趋势类似,无明显差异(p0.05)。3、间断温和负压环境促进MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞死亡体外间断温和负压环境下培养的MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞凋亡比例较大,活细胞比例低于常压培养同类细胞(p0.05),且TNF-α分泌量多于常压培养的 MDA-MB-231 细胞(p0.05)。动物实验第14天获取的负压组MDA-MB-231肿瘤标本较对照组Caspase-3表达量增多;第28天获取的负压组MDA-MB-231肿瘤标本坏死面积比例较常压组标本高(p0.05)。研究结论:1、间断温和负压环境培养增加MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞侵袭力,促进IL-8分泌,增加瘤体内血管密度及肿瘤细胞上皮间质化程度。2、间断温和负压环境培养对MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞增殖影响不显著,但可促进MDA-MB-231细胞分泌IL-6增多。同时,动物模型中,间断温和负压直接作用可造成皮下组织浅层瞬时乏氧细胞增多,但皮下种植瘤瞬时乏氧细胞变化不明显。间断温和负压主要影响皮下种植瘤局部微环境,如增强炎性因子分泌及促进血管增多。3、间断温和负压使MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞凋亡比例增多,活细胞比例减少,同时促进TNF-α分泌。在MDA-MB-231瘤体生长早期,间断温和负压可使凋亡相关蛋白表达增多;在MDA-MB-231瘤体生长中后期,间断温和负压可使瘤体坏死面积比例明显增大。
【图文】：

负压,连接装置,细胞培养,三阴

断温和负压对ＭＤＡ－ＭＢ－２３１三阴性乳腺细胞侵Ｉｎｆｌｏｗ邋Ａ逦Ｄ逡逑ｋｚ—＾逦ｉ—ｃ＝＞逡逑Ｏｕｔｆｌｏｗ逡逑断温和负压细胞培养系统逡逑口；邋Ｂ进气口控制阀；Ｃ负压监测器；Ｄ细胞培养皿；Ｅ：通过Ｃ监测系统内负压值，再根据Ｃ提示数据调节Ｂ，，使值恒定于－２５邋ｍｍＨｇ。逡逑

酶联免疫吸附实验,组间,培养细胞,上清液

１．５－逡逑Ｉ邋，0．邋＿邋ｆ逡逑ＭＢ逡逑。．５．邋■逡逑０．０－Ｉ￣＾逦邋＼￣——逡逑ＯｍｍＨｇ逦－２５ｍｍＨｇ逡逑细胞侵袭实验逡逑组透膜ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞镜下观（２００邋Ｘ邋）；逡逑Ｈｇ邋组透膜邋ＭＤＡ－ＭＢ－２３１邋细胞镜下观（２０0ｘ）；逡逑膜细胞结晶紫脱色液在５９５ｎｍ测量的ＯＤ值的组间比较：．７６邋±０．０７，较常压组（ＯｍｍＨｇ组）为１．０６邋±０．０６；提示多于常压组（ｐ邋＜０．０５）。逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

【参考文献】