内质网应激在黑素瘤自噬中的作用机制

发布时间：2020-05-19 08:17

【摘要】：目的通过研究人黑素瘤细胞系A375和MEL624对B-Raf抑制剂达拉菲尼诱导耐药性的机制,探讨内质网应激在黑素瘤自噬中的作用机制。首先研究B-Raf抑制剂达拉菲尼是否可以在两种黑色素瘤细胞系中引起自噬和内质网应激。其次,达拉菲尼诱导的自噬是否通过内质网应激调控。最后,阻断内质网应激和自噬是否可以增加达拉菲尼治疗黑色素瘤细胞的功效。方法1、常规体外培养黑素瘤细胞系A375和MEL624,将黑素瘤细胞系A375和MEL624分别用浓度为0nM、10nM、100nM、250nM、500nM的达拉菲尼处理,24小时后用Western blot分别检测两种细胞系的自噬相关蛋白LC3I/II和P62以及内质网应激相关蛋白p-PERK和CHOP的表达情况。2、脂质体2000转染黑素瘤细胞制备针对PERK的小干扰RNA(PERK-siRNA)和非目标控制小干扰RNA(NTC-siRNA),针对PERK的小干扰RNA将PERK蛋白水平降低大约70%。用达拉菲尼(100nM)处理两种细胞系的PERK-siRNA和NTC-siRNA,设置空白对照组,24小时后将细胞收集并通过Western blot检测CHOP、IRE1α、P62、LC3I/II在两种细胞系中的表达情况。3、用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4PBA 10nM)处理人黑色素瘤细胞A375和MEL624 1小时,随后用达拉菲尼(100nM)处理24小时,同时设置空白对照组。收集细胞并通过CCK-8检测细胞生存能力。4、在黑素瘤细胞系A375和MEL624中添加自噬抑制剂3-甲基腺苷(3-MA 2nM),同时设置空白对照组,然后用不同浓度的达拉菲尼处理两种黑素瘤细胞系24小时。处理结束后,通过CCK-8检测细胞生存能力。结果1、Western blot分别检测黑素瘤细胞系A375和MEL624的LC3I/II和P62表达水平发现随达拉菲尼浓度的升高,LC3I/II的表达水平显著增高,同时伴有P62表达水平显著下降。用上述同样方法,Western blot分别检测两种细胞系的p-PERK和CHOP表达水平发现p-PERK和CHOP表达水平随达拉菲尼浓度升高而表达水平增高。2、使用小干扰RNA将PERK基因敲低后,PERK蛋白表达水平降低大约70%。通过Western blot分别检测发现,PERK敲低后,CHOP、IRE1α表达量减少;同时,P62表达量增加,LC3II/I表达量减少。3、仅用达拉菲尼处理组与同时应用4-苯基丁酸处理组相比细胞存活率更高。4、与3-甲基腺苷同时处理组相比,仅用达拉菲尼组细胞存活率更高。结论1、在黑素瘤细胞中,B-Raf抑制剂诱导的自噬和内质网应激呈剂量依赖性。2、在黑素瘤细胞中,抑制内质网应激可调节自噬水平。3、内质网应激可保护黑素瘤细胞免受B-Raf抑制剂介导的细胞凋亡。4、内质网应激诱导的自噬可保护黑素瘤细胞免受B-Raf抑制剂介导的细胞凋亡。
【图文】：

黑素瘤细胞,自噬,表达水平,统计学意义

黑素瘤细胞系A375和MEL624分别用浓度为0nM、10nM、100nM、250nM、500nM的达拉菲尼处理24小时后，用Western blot分别检测黑素瘤细胞系A375和MEL624的LCI/II和P62表达水平（图1A和B），发现随达拉菲尼浓度的升高LC3I/II的水平显著增高，同时伴有显著的P62水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。用上述同样方法，Western blot分别检测黑素瘤细胞系A375和MEL624的p-PERK和CHOP表达水平（图2A和B）发现p-PERK和CHOP表达水平随达拉菲尼浓度升高而表达水平增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。A

黑素瘤细胞,表达水平,统计学意义

同时伴有显著的P62水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。用上述同样方法，，Western blot分别检测黑素瘤细胞系A375和MEL624的p-PERK和CHOP表达水平（图2A和B）发现p-PERK和CHOP表达水平随达拉菲尼浓度升高而表达水平增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。A
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.5

【参考文献】