Rab23通过调控皮肤鳞癌细胞自噬促进肿瘤侵袭的分子机制研究

发布时间：2020-05-20 13:57

【摘要】：目的:皮肤鳞状细胞癌(cSCC)是皮肤常见的恶性肿瘤之一,侵袭性强是影响其预后的关键因素。研究发现皮肤鳞癌的发生、发展及侵袭转移与肿瘤细胞自噬有关;课题组前期在cSCC中研究证实Rab23可促进皮肤鳞癌细胞的侵袭,而且鳞癌组织自噬水平升高与鳞癌进展关系密切;然而,Rab23对鳞癌自噬水平的影响还不明确,特别是Rab23在皮肤鳞癌细胞自噬促进肿瘤侵袭的作用及分子调控机制尚不明确。因此,本课题拟明确Rab23是否影响鳞癌细胞自噬,并进一步探讨Rab23在皮肤鳞癌细胞自噬促进肿瘤侵袭中的作用及分子机制。方法:①通过GEO和TCGA数据库下载基因表达原始数据,利用生物信息学方法对头颈部鳞癌组织中Rab23与自噬及侵袭相关的分子表达水平进行分析,初步探讨Rab23与鳞癌自噬及侵袭的关系,进一步分析Rab23与自噬标记分子异常共表达对患者生存率的影响;②利用课题组已经建立的解放军总医院皮肤科病理组织标本库资源,免疫组化检测41例皮肤鳞癌组织、49例光线性角化病与30例头面部色素痣切除后边缘正常皮肤组织中Rab23的表达水平,对标本库中同期保存的上述组织自噬标记蛋白Beclin1、LC3B及p62免疫组化切片,深度分析Rab23的表达水平与自噬相关蛋白表达的相关性及与临床病理特征的关系;③利用课题组前期构建的转染表达不同Rab23水平的细胞系,激光共聚焦观察Rab23对自噬囊泡数量的影响以及是否与自噬囊泡共定位;蛋白免疫印迹检测Rab23对自噬标记蛋白Beclin1、LC3B及p62水平的影响,以及调控自噬相关信号通路AKT/mTOR、MEK/ERK1/2;④最后通过基因干扰Atg5的表达、药物抑制或激活细胞的自噬水平,观察Rab23对鳞癌自噬促进肿瘤细胞侵袭病理过程的影响。结果:①生物信息学分析结果示:在所有基因表达芯片中,与正常组织相比,在转录水平均未发现自噬标记物Beclin1、LC3B表达水平明显升高。高表达MMP1 mRNA见于上皮性癌的整个病变过程,Rab23与MMP1表达呈正相关关系(P0.05或P0.01);Rab23 表达与 HIF1A、MAPK8 和 ARFGAP1 呈正相关(P0.01),但与 mTOR、BCL2L1表达呈负相关(P0.05或P0.01)。高表达Rab23 mRNA可促进皮肤鳞癌神经侵袭。TCGA分析结果与Rab23单一因素相比,Rab23联合自噬相关标记分子Beclin1、LC3B及p62的表达异常,患者总生存率(OS)下降(P0.05),无病生存率(DFS)有降低趋势,尽管无统计学意义(P0.05)②Rab23及自噬相关蛋白在皮肤鳞癌、光线性角化病中表达水平:与正常皮肤组织相比,免疫组化检测结果显示Rab23和自噬标记物Beclin1、LC3B在光线性角化病、皮肤鳞癌中表达水平逐渐升高,而p62水平逐渐降低(P0.01);组间两两比较,从正常组织、光线性角化病到皮肤鳞癌,除LC3B在光线性角化病与正常组织之间,以及p62在皮肤鳞癌与光线性角化病之间无差别外,其余组间比较均有统计学意义(P0.01);Rab23表达与自噬标记物Beclin1、LC3B表达呈正相关关系,与p62表达呈负相关(P0.01);Rab23、Beclin1、LC3B及p62与肿瘤分化级别有关(P0.05或P0.01),其中 LC3B、Beclin1 与临床分期关系显著(P0.05或P0.01),而且 Beclin1与肿瘤大小有关(P0.05);Rab23、LC3B、Beclin1及p62的蛋白表达水平与患者病程、年龄、性别,侵袭关系不明显(P0.05)。③激光共聚焦结果显示与EGFP标记的空载体组(Vector)相比,EGFP标记Rab23野生型(Rab23WT)和Rab23持续活化型(Rab23Q68L)可以增加自噬囊泡的数量(P0.01),并且与其共定位,而Rab23持续抑制型(Rab23S23N)和Vector组自噬囊泡数量减少,自噬活化与GTP结合形式有关;蛋白免疫印迹结果显示与Vector组相比,Rab23 WT和Rab23Q68L组可以促进皮肤鳞癌细胞Beclin1、LC3B表达水平(P0.05或P0.01);Rab23-WT 和 Rab23Q68L 组 p-mTOR 和 p-ERK 表达均升高(P0.05 或P0.01)。Rab23通过正向调控ERK和mTOR的表达,最终促进鳞癌细胞的自噬。给予自噬促进剂雷帕霉素及自噬抑制剂氯喹处理后,鳞癌细胞Beclin1、LC3B和p62的自噬水平呈升高或降低的趋势。④Rab23WT和Vector组转染Atg5siRNA后,细胞自噬水平下降,侵袭能力、迁移能力和创伤愈合能力均减弱。与转染Atg5-siRNA的Vector组相比,转染Atg5-siRNA Rab23WT组侵袭能力、迁移能力和创伤愈合能力均增强(P0.05),接近于转染Atg5-siRNA-NC Vector 细胞组,但仍小于转染 Atg5-siRNA-NC Rab23WT 细胞组(P0.05)。变化趋势:转染 Atg5-siRNAVector 细胞组转染 Atg5-siRNARab23WT细胞组≈转染 Atg5-siRNA-NC Vector 细胞组转染 Atg5-siRNA-NC Rab23WT 细胞组。给予氯喹(40uM)和雷帕霉素(50nM)处理后,细胞侵袭能力、迁移能力和创合愈合能力均降低,变化趋势与基因干扰Atg5表达相一致。结论:①Rab23可以促进基质金属蛋白酶MMP1mRNA表达,二者呈正相关关系;②皮肤鳞癌组织中Rab23及自噬相关基因HIF1A、MAPK8 mRNA表达上调,mTOR、BCL2L1表达下调,促进皮肤鳞癌神经侵袭;③Rab23和自噬标记分子Beclin1、LC3B及p62mRNA异常共表达,患者总生存率下降;④皮肤鳞癌组织中Rab23高表达,且与鳞癌自噬水平、分化程度及临床分期相关;⑤Rab23可以促进皮肤鳞癌细胞自噬:Rab23与自噬囊泡共定位,并可增加其数量,还可以促进自噬标记蛋白Beclin1、LC3B的表达。其机制与正向调控ERK和mTOR信号通路有关。⑥抑制鳞癌细胞自噬Atg5的表达,细胞侵袭能力、迁移能力及创伤愈合能力明显下降;Rab23上调皮肤鳞癌细胞自噬水平,促进皮肤鳞癌细胞的侵袭和迁移。
【图文】：

尿路上皮癌,固有膜,病例

４．３复诊原则对剩余的５４７例重新阅片并进行病理学分级。由三位资深的病理逡逑医师分别单独复阅切片并提出诊断意见，如遇三位病理医师诊断意见不一致，当逡逑出现２：１时以２个相同的诊断为病理最终诊断；当出现１：１：１时，则剔除该病例。逡逑经复诊共剔除病例９２例。逡逑４．４再次病例剔除标准为保证科内存档资料的完整性以便于满足患者后续的逡逑医疗需求，对复诊后所得４８２例病例的组织块进行评估，符合以下条件之一者即逡逑剔除：１）病理归档蜡块不齐全者；２）组织较小，蜡块中组织的最大面积切．５ｘ０．５ｃｍ２；逡逑３）送检俎织虽然较多，但综合ＨＥ切片，同一病例中任意一张切片中具实际诊逡逑断意义的肿瘤组织面积均切．５ｘ０．５ｃｍ２；共剔除病例１８４例。逡逑５．入组病例经过上述严格的原始病例检索、整理、样本含量估计、随机化抽逡逑样、病理学复诊、病例筛选、剔除、复阅并重新分级及再次剔除，，最终剩余２９８逡逑

分布图,膀胱,分布图,浸润性癌

２０１０－２０１６年７年间中国人民解放军总医院共诊治膀胱ＵＮ３６１０例，其中呈逡逑外生性乳头状生长者３２４０例（８９．７５％），内翻性生长者３２７例（９．０６％），平坦逡逑型非浸润性者４３例（１．１９％）（图２）。逡逑内翻性，３２７例平坦型，４３例，逡逑９．０６％逦＼逦厂一邋１．１９％逡逑图２．邋２０１０？２０１６年间中国人民解放军总医院诊治非特殊类型膀胱ＵＮ生长方式分布图逡逑经过随机抽样、病例筛选及复诊，剔除质量不合格以及三位阅片专家意见不逡逑一致的病例，剩余４８２例，重新分类前外生性ＵＮ２４９例，内翻性ＵＮ２３３例；按生逡逑长方式重新分类后外生性者２１６例，内翻性者２６６例，其中４１例由外生组移入内翻逡逑组，８例由内翻组移入外生组，此外２例内翻性非浸润ＵＮ、２例外生性非浸润性逡逑ＵＮ以及２３例外生性浸润癌均移入内翻性浸润癌组中（见表３邋）。逡逑４８２例ＵＮ经二次剔除不符合要求的病例后剩余２９８例，其中经生长方式调整逡逑的病例主要集中在浸润性癌中，原诊断为外生性浸润性癌中的２０例（４２．５５％）调逡逑整为内翻性浸润性癌
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.5

【参考文献】