高糖经LncRNA MEG3-miR483-3p途径调控HepG2细胞的ERP29的作用及机制

发布时间：2020-05-20 18:23

【摘要】：目的:肝癌是世界上常见的一种癌症,它的发病率在很多国家都呈增趋势加。在中国,男性患者中的发病率也排名前五。手术切除、肝移植以及局部放疗等被认为是有效的治疗措施。然而,经过治疗后,肝癌的五年复发率仍然很高,有很多因素与高复发率有关。近年来,随着糖尿病患者数量的增加,肝癌合并糖尿的患者数量也在增加。血糖的控制也被认为是影响肝癌进展及其预后的一项危险因素。而高糖浓度对肝癌细胞功能影响的调控网络及RNA与蛋白质表达水平的研究尚不多见。本研究将通过蛋白组学技术,以内质网的蛋白变化为切入点,筛选候选蛋白质并对不同糖浓度条件下,影响该蛋白表达的机制进行进一步研究,初步建立一条调控途径,在基因水平和蛋白水平探索高糖浓度对肝癌细胞发生发展和功能的影响。方法:1、运用Label-free蛋白组学方法分析高糖对人肝细胞癌细胞系(HepG2)内质网蛋白的影响:体外条件下培养人肝细胞癌细胞系(HepG2),分为正常对照组(DMEM低糖培养基,葡萄糖浓度为5.6mol/L)和高糖对照组(DMEM高糖培养基,葡萄糖浓度为25mmol/L)。利用超速离心及密度梯度离心技术,对HepG2细胞进行亚细胞的分离与鉴定,分离中较为纯化的内质网。运用Label-free蛋白组学方法,对分离出的内质网进行质谱分析,得到差异化蛋白结果。2、利用生物信息学方法,对差异化蛋白进行筛选,挑选出与内质网功能相关的蛋白ERP29进行进一步机制的研究。在细胞层面利用western法验证高糖对ERP29表达的影响,在组织层面采用免疫组化技术对糖尿病与非糖尿病肝癌组织石蜡切片进行ERP29的染色3、分析ERP29对肝癌细胞(HepG2)生物学行为的影响:采用人肝细胞癌细胞系(HepG2)分为正常对照组(DMEM低糖培养基,含葡萄糖为5.6mmol/L)、高糖干预组(DMEM高糖培养基,含葡萄糖为25mmol/L)、高糖ERP29过表达组以及高糖ERP29低表达组,利用CCK-8、细胞划痕试验揭示ERP29对HepG2细胞增殖、迁移功能的影响,用western blot技术检测E-cadherin、Vimentin和N-cadherin等上皮间质化现象相关的蛋白表达的影响。4、探寻调控ERP29的miRNA:通过查找miRNA数据库(Tarbase,TargetScanHuman,miRTargetLink Human等),筛选出与ERP29可能相关的miRNA。对候选miRNA在高糖和低糖条件下做RT-PCR后进一步筛选miRNA。将人肝细胞癌细胞系分为,高糖miRNA mimics组、高糖miRNA inhibitor组、高糖对照组和正常对照组。转染相应试剂后,利用PCR法验证miR-483-3p水平,并用Western Blotting检测ERP29的表达量变化,验证miR-483-3p的变化是否影响ERP29的表达。进一步采用CCK8、划痕试验验证miR-483-3p对HepG2细胞增殖、迁移等生物学行为的影响。5、进一步揭示调控mir-483-3p的上游LncRNA再通过LncRNA数据库(LncBase,Starbase)筛选出与mir-483-3p有关的LncRNA。对候选LncRNA在高糖和低糖条件下做RT-PCR后进一步筛选。人肝细胞癌细胞系(HepG2)分为正常对照组、高糖对照组、高糖MEG3过表达组和高糖空载体组。各组细胞分别干预不同时间(0、24h、48h、72h)后,用荧光定量PCR法检测MEG3和miR-483-3p以及用Western Blotting法检测ERP29的表达量变化,并进行对比。进一步采用利用CCK8、划痕试验证实LncRNA MEG3HepG2细胞增殖、迁移等生物学行为的影响。结果:1、成功分离内质网亚细胞器成分,运用label-free方法筛选出内质网相关蛋白ERP29。2、人肝细胞癌细胞系在不同糖浓度条件下分别干预24h、48h、72h后,Western Blotting结果显示,与正常对照组相比,高糖组ERP29表达量在72h显著下降(P0.05),而24h、48h的表达量组间并没有明显差距。3、免疫组织化学染色结果显示,与正常肝组织相比,肝癌合并以及不合并糖尿病组的患者石蜡切片ERP29染色均降低,且肝癌合并糖尿病组ERP29染色进一步降低。4、过表达及敲减ERP29后,CCK-8和细胞划痕试验表明,过表达组细胞增殖和迁移能力下降,而敲减组增殖和迁移能力上升。同时对上皮间质化标记物验证后发现,过表达组上皮标志物E-cadherin的表达量下降,间质标志物Vimentin和N-cadherin的表达量上升(p0.05),敲减组结果相反(p0.05)。5、转染miR-483-3p的mimics和inhibitor后培养24h、48h后,Western Blot显示,与正常对照组及高糖对照组相比,mimics组ERP29表达水平均明显下降(p0.05),而inhibitor组ERP29表达水平明显增加(p0.05)。同时,CCK-8和划痕试验表明,mimics组HepG2细胞增殖和侵袭能力增加,而inhibitor组增殖和侵袭能力下降(p0.05)。6、转染MEG3质粒后培养24h、48h,RT-PCR结果显示,与正常对照组相比,过表达组miR-483-3p表达水平降低,且下游ERP29表达水平增加(p0.05)。CCK-8和划痕试验表明,过表达MEG3组HepG2细胞增殖和侵袭能力下降。进一步研究发现,敲减miR-483-3p后再过表达MEG3,下游ERP29的表达水平并没有发生变化(p0.05)。7、初步建立LncRNA MEG3-miR-483-3p-ERP29的调控网络。LncRNA MEG3可能通过miR-483-3p影响ERP29的表达,进一步影响HepG2细胞的功能。ERP29对HepG2细胞功能的影响可能通过上皮间质转化途径,使肝癌细胞极性丧失,迁移和运动能力增强。
【图文】：

示意图,标记物,内质网,转离

19图 1.内质网的分离与鉴定A.蔗糖梯度密度离心示意图；B.密度梯度离心后内质网成分聚积位置；C.细胞器特异性标记物的检测。(内质网标记物：calreticulin；线粒体标记物：COXIV;高尔基体标记物：58k Golg细胞质标记物：β-actinTotal:细胞总蛋白；P1:1000 转离心后沉淀；S1：1000 转离心后上清；P8：800转离心后沉淀；S8：8000 转离心后上清；ER：图 1.B 画圈成分）

肝组织,患者,糖条,蛋白质组学

图 2.不同分组患者肝组织 ERP29 组化染色比较1.3.4 HepG2 细胞中不同糖浓度条件下的 ERP29 表达情况与正常对照组（5.6mmol/L）相比，高糖干预组（25mmol/L）ERP29 的表达在 24h、48h 时未发现明显的差异。而在 72h 时，，高糖干预组 ERP29 蛋白表达水平下降明显，有统计学差异（P<0.05）。对 HepG2 细胞高糖条件下继续干预，使干预时间达到 96h，未发现 ERP29 表达有回调趋势，与正常对照组相比下降趋势仍十分明显，且有统计学差异（P<0.05）。Western Blot 对 ERP29 在高糖下干预的表达结果，与蛋白质组学结果基本一致，并进一步证实，ERP29 在高糖干预下发生表达水平下调发生在 48h 之后。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7;R587.1

【参考文献】