组织因子靶向纳米粒介导光化学梗塞法治疗实体淋巴瘤的实验研究

发布时间：2020-05-21 14:39

【摘要】：TF在凝血过程中发挥着至关重要的作用,能与血浆凝血因子Ⅶ/Ⅶa(FⅦ/Ⅶa)特异性结合,形成的TF-FⅦa复合物可以激活FⅨ和FⅩ,激活的FX(FXa)和共因子(FVa)可以水解凝血酶原,最终导致凝血酶形成,引发血液凝固。越来越多的研究表明,很多实体瘤和血液系统恶性肿瘤的瘤细胞均高表达TF,因为肿痛血管内皮细胞本身的不完整和内皮细胞间连接的不紧密,导致血管具有一定的可透过性和TF的渗漏,从而使肿瘤血管的内皮细胞表面高表达TF。这些TF既与肿瘤血管新生及转移相关,也与肿瘤患者的血栓性静脉炎关系密切,这在临床上被称为Trousseau's综合症。而对于正常组织血管而言,TF分布在血管外层等血液循环之外的区域,只有当血管损伤或内皮破损时血液才有机会和这些表达TF的细胞接触,从而启动上述凝血过程。所以,选择TF作为靶向肿^茄苣谄は赴陌械憔哂辛己玫奶匾煨浴１究翁庾榍捌谘芯康腅GFP-EGF1蛋白具有TF特异性和高度的亲和力,且将其连接于聚乙二醇-聚乳酸-聚羟基乙酸纳米粒(PLGA)纳米粒表面后构建的EGFP-EGF1-PLGA纳米粒也具有TF靶向性。光化学反应能够使血管内皮细胞受损,引发血小板聚集,从而形成血栓。其发生机制为：特定波长的光照射使血管内皮细胞膜上的光敏剂受到激发,此激发状态下的光敏剂可以把能量传递给周围的氧,生成高活性的单态氧,单态氧和细胞膜、细胞核、细胞质等中的重要生物大分子(如蛋白质、脂质和核酸等)发生氧化反应,从而启动脂质过氧化反应,损伤血管内皮细胞,从而引起TF的释放激活凝血瀑布,造成局部的血栓形成。在该光化学反应过程中,光敏剂作为能量的载体和反应的桥梁,发挥着关键性的作用。血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ethe, HMME),是种成分单一、性能稳定的新型光敏剂,其激发峰为395nm,发射峰为613nm。它能够从体内迅速清除,毒性明显低于第一代光敏剂(血卟啉衍生物)。由于血卟啉单甲醚体内注射后很快就被肝脏的枯否(Kupffer)细胞吞噬,其血液中的浓度会迅速下降,如果想造成肝脏以外的,身体其他目标部位的梗塞,必须提高初始的给药剂量。全身m药浓度过高除造成肝脏损害外,还需要避光来防止日光照射产生活性氧对身体浅表部位的伤害。那么采用靶向给药的方式可大大降低全身给药剂量,既能在目标部位形成较高浓度,又可以尽量减少正常部位药物浓度,从而将药物对正常组织的损伤降至最低。由此,研究者设想：能否将血卟啉单甲醚包载在EGF1-EGFP-NP内部,通过纳米粒的TF靶向性运载到高表达TF的肿瘤血管,然后针对瘤体采用冷光源照射,局部产生活性氧损伤血管内皮可引起TF进一步释放,这样既给TF靶向纳米粒提供更多的靶标募集更多的纳米粒,也可通过这种瀑布效应产生更多的TF促发进一步凝血反应,从而特异性梗塞肿瘤血管。鉴于以上基础,本研究将制备包载血卟啉单甲醚的EGF1-EGFP-NP,选取高表达TF的脑微血管内皮细胞(BMECs)作为肿瘤血管内皮模型,选取CA46淋巴瘤细胞复制动物实体瘤模型,体内及体外研究该纳米粒在冷光源激发下,是否能靶向到高表达TF的肿瘤血管内皮?是否能激发局部TF的进一步释放及载血卟啉单甲醚纳米粒子的不断聚集,导致局部的血栓形成?是否可中断肿瘤细胞的血液供应,发挥抗肿瘤效应?期望能为实体肿瘤的治疗提供新的思路。第一部分载血卟啉单甲醚的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒的构建及体外评价目的将血卟啉单甲醚载入EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒中,并对该纳米粒的理化性质进行鉴定：验证HMME-ENP对脑微血管内皮细胞(BMECs)的靶向性；评价在冷光源照射下HMME-ENP诱导BMECs产生活性氧和组织因子的作用。方法 1)采用单乳法,合成出包载血卟啉单甲醚的PLGA纳米粒(HMME-NP),之后将EGFP-EGF1蛋白巯基化,连接于HMME-NP表面,合成出MME-ENP;通过粒径测定仪对纳米粒的粒径进行测定；通过普通电镜观察纳米粒的形态,并通过BCA法测定纳米粒的EGFP-EGF1蛋白连接效率；提取纳米粒中的血卟啉单甲醚,计算血卟啉单甲醚的载药量。 2)两次消化加Percoll梯度离心法提取大鼠BMECs, TNFα上调BMECs TF的表达,构建体外血管损伤模型；在ENP纳米粒表面连接香豆素-6示踪纳米粒,进行细胞摄取实验；通过Dihydroethidium (DHE)超氧化物阴离子荧光探针检测BMECs细胞光照后活性氧产生情况；通过实时定量PCR和western-blot,检测BMECs细胞光照后TF表达水平的改变。结果 1)载入血卟啉单甲醚的ENP (HMME-ENP)粒径大小约110-120rnm左右,外观大小均一、圆整。HMME-ENP纳米粒表面EGFP-EGF1蛋白连接效率为39.27%。血卟啉单甲醚的载药量约4.24ug/mg。 2)大鼠BMECs原代细胞存在TF的少量表达,TNF (100ng/ml,6h)可以刺激细胞上调TF表达；细胞摄取实验显示,连接有EGF1-EGFP蛋白的ENP比NP更利于细胞摄取； 3)在冷光源照射下,HMME-ENP可以诱导BMECs细胞产生活性氧和促进TF表达,且作用强于HMME-NP诱导的。结论 1) HMME-ENP粒径大小均一,EGFP-EGF1蛋白的成功连接,HMME的载药量都可满足后续实验需求; 2) HMME-ENP体外血管损伤模型中具有TF靶向性： 3)在冷光源作用下,HMME-ENP纳米粒中包载的HMME可以促进活性氧产生及TF表达。第二部分载血卟啉单甲醚的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒在小鼠淋巴瘤皮下瘤模型中的评价目的构建小鼠淋巴瘤的皮下瘤模型；用Dir示踪MME-NP纳米粒,在淋巴瘤皮下瘤模型中,进一步验证其TF靶向性；初步评价冷光源照射下,MME-ENP对小鼠淋巴瘤的干预作用。方法 1)以NOD/Scid小鼠为种瘤对象,挑选淋巴瘤细胞系CA46细胞以1*107的密度终种植在小鼠右侧肩胛区皮下： 2)成瘤小鼠尾静脉分别注射Dir标记的HMME-ENP及HMME-NP,冷光源照射局部瘤体后给予活体成像,观察2h、6h、12h、24h等各时间点纳米粒在小鼠体内的分布；24h点处死小鼠,取心、脑、肝脏、脾脏、肾、肺、瘤体等进行器官成像,计算组织荧光强度； 3)免疫荧光检测小鼠瘤体冰冻切片的活性氧和TF分布；HE染色检测血栓；结果 1)CA46细胞种植3-4周后,80%以上NOD/Scid小鼠均可见瘤细胞种植部位皮下瘤的形成； 2)活体成像结果显示：a)在2h、6h、12h、24h等各时间点,尾静脉注射ENP的小鼠瘤体处纳米粒聚集均强于注射NP小鼠；给予光照后,尾静脉注射ENP的纳米粒聚集仍强于NP聚集; b)给予光照后,尾静脉注射ENP的纳米粒聚集强于未光照组ENP聚集;光照后尾静脉注射NP的纳米粒聚集强于未光照组NP聚集； c)给予光照后,尾静脉注射ENP的纳米粒聚集在2h、6h、12h、24h等所有时间点中,6h达最高。 3)器官成像显示：a)24h点纳米粒在肝脏的聚集最多,其次为脾脏、瘤体;b)余结果与上述活体成像吻合； 4)瘤体冰冻切片免疫荧光显示纳米粒聚集的部位与TF表达区域吻合： 5)注射ENP的小鼠瘤体活性氧、血栓及TF表达等均较注射NP的。结论 1)ENP在小鼠淋巴瘤皮下瘤模型中具有靶向性; 2)在冷光源局部照射下,HMME-ENP可以促进瘤体产生更多的活性氧、TF、和血栓,有望为肿瘤靶向治疗提供一个新的策略。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.1

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