LncRNA调控STAT5信号通路诱导THP-1细胞向DC分化作用与机制研究

发布时间：2020-05-24 22:43

【摘要】：研究背景白血病是血液系统恶性肿瘤,其发生的主要机制是由于造血细胞在某一分化阶段出现了分化障碍,不能继续终末分化,而保留其恶性增殖的能力。目前治疗白血病的方法主要有造血干细胞移植及化疗,但造血干细胞移植费用昂贵且受供者来源限制,化疗副作用及微小残留病灶使白血病易复发。因此寻找新的治疗白血病的方法和药物成为白血病领域亟待解决的问题。其中将白血病细胞向免疫细胞定向诱导分化是目前研究的热点,拥有良好的应用前景。树突状细胞(DC)是体内功能最强大的抗原提呈细胞(APC),在抗肿瘤、抵抗病原微生物感染及维持机体内环境稳定中发挥着重要作用。但发现白血病患者DC数量少、功能低以及伴有发育及成熟障碍,不能有效激发适应性免疫应答,杀伤白血病细胞。因此提高白血病患者体内树突状细胞(DC)的数量及功能将为治疗白血病提供新的途径。直接将白血病细胞诱导成DC为有效途径,这种白血病来源的DC含白血病相关的特异性抗原,能够直接把白血病抗原呈递给T细胞,进而杀伤白血病细胞。目前,主要通过细胞因子将白血病细胞定向向DC诱导,但是由于其诱导机制不明确导致诱导DC效率不高、功能不稳定,因此明确其诱导分化机制是提高诱导效率与功能的突破口。信号转导与转录激活因子(STAT)家族成员在调控DC发育分化过程中发挥重要作用,研究发现细胞因子可以通过活化STAT3促进DC特异性核转录因子E2-2转录进而促进浆细胞样树突状细胞(pDC)发育分化,也可以通过STAT5促进DC特异性核转录因子ID2转录进而促进经典树突状细胞(cDC)的分化发育。目前,有关调控STAT诱导DC分化的研究主要围绕正常人单核细胞诱导方面,但其在影响白血病细胞定向分化为DC中的作用尚不清楚。近年来,随着人类基因组计划的完成及表观遗传学发展,长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)对基因表达及生理功能的调控成为新兴热点。LncRNA是指长度大于200个核苷酸的RNA,本身不编码蛋白质,但可通过转录后调控或翻译后修饰等表观遗传调控作用影响其靶向物的表达或功能。近年来的研究发现LncRNA在体细胞的分化发育、肿瘤的恶性转移中发挥重要作用。在DC细胞中同样也表达大量的DC,但其在DC的发育分化中的作用知之甚少,因此此方向的深入探索有望成为靶向治疗白血病的突破口。研究目的本研究以人急性单核白血病细胞THP-1为研究对象,利用粒细胞巨噬细胞—集落刺激因子(GM-CSF)联合白细胞介素4(IL-4)诱导其向DC分化,用脂多糖(LPS)诱导THP-1来源DC成熟,探讨THP-1向树突状细胞(DC)诱导分化机制,以期为白血病的治疗提供新的靶点和途径。实验方法实验将人急性单核白血病细胞THP-1随机分为两组,实验组以粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)联合白细胞介素4(IL-4)诱导其向DC分化,脂多糖(LPS)诱导DC成熟,对照组培养于RPMI1640完全培养基,培养第7天,收集两组细胞,倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测DC表面标志性分子CD11c及DC表面功能分子(共刺激分子CD80、CD86、组织相容性抗原HLA-DR、趋化因子CCR7表达,qPCR法检测STAT5及ID2转录水平,Western blot检测STAT5总蛋白及磷酸化水平。在此基础上,本课题利用Agilent高通量基因芯片对白血病源DC分化过程中靶向ID2的LncRNA进行了初步的筛选,并通过qPCR法对其进行表达验证和机制探讨。实验结果实验结果显示与对照组相比,THP-1细胞经细胞因子诱导后可见明显的树突状突起,呈现DC形态学变化;流式细胞术检测结果显示THP-1细胞经细胞因子诱导后细胞表面DC标志性分子CD11c及功能分子(共刺激分子CD80、CD86、组织相容性抗原HLA-DR、趋化因子CCR7表达均出现明显升高现象(P0.05);qPCR检测结果显示,THP-1细胞经细胞因子诱导后STAT5、DC特异性核转录因子ID2转录水平升高(P0.05);Western blot检测STAT5总蛋白表达及磷酸化水平均出现明显升高现象(P0.05)。我们对白血病源DC分化过程中靶向ID2 LncRNA筛选结果显示LncRNA Lnc-CHCHD7-4-1出现明显升高(P0.05),LncRNA ENST00000222753出现明显降低(P0.05);相关性分析显示LncRNA Lnc-CHCHD7-4-1与ID2表达呈显著正相关(Pearson r=0.9944,P0.05),LncRNA ENST00000222753与ID2表达呈显著负相关(Pearson r=-0.8830,P0.05)。实验结论以上结果表明,THP-1细胞为白血病源DC敏感细胞株,在白血病源DC诱导分化过程中STAT信号通路发挥重要作用;STAT5通过调控ID2表达在白血病源DC诱导分化过程中发挥重要作用。同时,我们通过相关性分析发现LncRNALnc-CHCHD7-4-1与ID2呈显著正相关,而LncRNA ENST00000222753与ID2呈显著性负相关,提示LncRNA调控STAT5/ID2信号通路可能是白血病THP-1细胞向DC分化的关键机制之一,靶向调控LncRNA/STAT5信号通路可能成为白血病诊断、治疗及预后评估的潜在有效新靶点与途径。
【图文】：

图 1. STAT 信号通路简介研究表明 STAT 家族在树突状细胞的分化发育中发挥非常关键的作用。树突发育主要由细胞因子调控，在细胞因子的作用下 STAT 的酪氨酸被细胞因子 JAK 激酶磷酸化，STAT 酪氨酸磷酸化导致 STAT 与受体分离然后二聚化，

图 2. 倒置显微镜观察诱导前后细胞形态变化（×200）注: A 为对照组 THP-1 细胞形态；B 为细胞因子诱导后观察组细胞形态。.1.2 THP-1 诱导前后 DC 表面特征性分子 CD11c 的表达
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.7

【参考文献】

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本文编号：2679111