SND1通过影响E-cadherin的表达进而影响乳腺癌细胞的表型

发布时间：2020-05-25 01:19

【摘要】：研究目的:在全球范围内,乳腺癌是女性人群中高发的癌症之一,其严重的危害着女性的健康,国际癌症研究所所发布的2012年全球癌症相关数据显示:在统计的所有癌症当中,女性乳腺癌的发病人数及死亡人数均为最高。乳腺癌细胞的侵袭、转移是乳腺癌重要的恶性生物学行为特征,也是导致患者预后不良的主要因素。上皮细胞向间质细胞转换称为上皮-间质转化,简称EMT。在此过程中,细胞表达的粘附分子发生改变,使细胞倾向于发生转移及侵袭。在上皮间质转化的过程中一个显著的特征就是肿瘤及侵袭抑制因子E-cadherin的下调,进而使得细胞之间的紧密连接减少,肿瘤细胞更容易侵袭到远端组织与器官,与此同时间质基因N-cadherin及fibronectin明显上调,更利于细胞的侵袭及转移。肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤组织自身血管网络的发展,恶性、生长活跃的肿瘤大多有明显的肿瘤血管生成。血管生成拟态简称VM,能使肿瘤细胞获得营养及生长因子以支持后续肿瘤细胞的生长及利于肿瘤细胞的转移。乳腺癌细胞的转移通常提示预后不佳,早期诊断并在转移前获得有效治疗的乳腺癌患者生存率高。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)及血管生成拟态(Vasculogenic mimicry,VM)是影响乳腺癌发生转移的重要环节,因此有效抑制上皮间质转化及血管生成拟态的发生对于预防乳腺癌细胞的转移及对提高患者生存率和改善预后具有重要意义。SND1蛋白作为一种多功能蛋白在多种肿瘤中高表达,SND1的异常升高与肿瘤患者的预后生存率密切相关。尽管SND1与乳腺癌进程的相关性已经基本明确,但是在乳腺癌中高水平的SND1对乳腺癌进展作用的具体分子机制还有很多空白有待补充。因此本实验的目的是探讨SND1如何调控乳腺癌细胞的上皮-间质转化及血管生成拟态进而影响乳腺癌转移的分子机制。研究方法1.利用慢病毒体系在MDA-MB-231细胞中构建稳定敲低SND1蛋白的细胞株,并用Western-Blot、q-PCR检测敲低效率。2.在野生型及敲低SND1的细胞株中利用体外的生物学功能实验(包括MTT、transwell侵袭实验、划痕实验、血管生成拟态实验)检测细胞增殖、侵袭、迁移及血管拟态生成拟态能力的变化。3.利用Western-Blot、q-PCR的方法检测上皮间质转化相关的marker分子在m RNA及蛋白水平的变化。4.用5-aza处理细胞检测E-cadherin蛋白的表达情况;用Me DIP和BSP的方法检测E-cadherin启动子甲基化的变化。5.利用Western-Blot、q-PCR的方法检测DNA甲基转移酶在m RNA及蛋白水平的变化。6.利用Ch IP及虫萤光素酶实验检测SND1对DNMT3A的转录调控;利用Ch IP检测DNMT3A结合到E-cadherin启动子的变化。研究结果1.在MDA-MB-231细胞中成功构建了稳定敲低SND1蛋白的细胞株MDA-MB-231-SND1-sh,SND1在蛋白及m RNA水平都明显降低。2.敲低SND1的细胞株相对于野生型细胞株来说其增殖、侵袭、迁移、血管拟态形成能力明显减弱。3.敲低SND1的细胞株相对于野生型细胞株来说上皮表型的marker分子E-cadherin在蛋白及m RNA水平都明显升高,间质表型的marker蛋白N-cadherin在蛋白水平明显下调。4.MDA-MB-231细胞株用5-aza处理后E-cadherin重新表达;敲低SND1的细胞株相对于野生型细胞株E-cadherin启动子甲基化明显减少。5.敲低SND1的细胞株相对于野生型细胞株来说DNMT3B及DNMT1在蛋白水平没有明显变化,而DNMT3A在蛋白水平及m RNA水平都明显降低。6.SND1通过转录激活DNMT3A的表达进一步影响E-cadherin启动子甲基化。研究结论:在乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞中,SND1通过转录激活DNMT3A的表达进一步使E-cadherin启动子高甲基化而抑制其表达,使细胞发生上皮间质转化及血管生成拟态的能力增强,进一步促进乳腺癌的发生发展。
【图文】：

分子机制,蛋白,结构域

图 1 血管生成拟态调节的分子机制（四）SND1 蛋白与肿瘤SND1（Staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白，又称 Tudor-SN或 p100，是一种进化上非常保存，在真核生物体中广泛表达的多功能蛋白。SND1是一个分子量达 100kD 的蛋白，由 5 个不同结构域组成，包括 N 端的 4 个连续的 SN 结构域及 C 端的 Tudor 结构域，它具有辅助激活因子和 RNA 剪切体的双重功能，可以同时通过转录和转录后水平调控功能基因的表达。在细胞核内SND1 利用 N 端的 SN 结构域以募集转录复合体及促进组蛋白乙酰化的方式直接促进目的基因的转录，行使辅助转录激活因子功能[58]。在细胞核外 SND1 通过其 C 端的 TSN 结构域结合小分子核糖核蛋白（snRNP），参与 RISC 复合物的形成，介导 Let7-miRNA 引发的基因沉默[59]。近年的研究结果表明 SND1 是一个非常有潜力的肿瘤分子标志：Sarkar,D等报道SND1在AEG-1协同下通过激活RISC功能促进肝细胞癌生长[60,61]，Egawa,S 通过蛋白组学方法鉴定 SND1 是前列腺癌的新潜在分子指标[62]，Nakagama,H 等发现 SND1 在结肠癌中的表达水平比正常

实验原理,糖胶,蛋白酶

28图 1.1MeDIP 实验原理NA(方法如前所述)ug 的蛋白酶 K 处理过的基因组 DNA 溶于 1m声，功率为 45%，超声 30s 停 30s，15 个循糖胶，取 200ng的超声过的 DNA跑胶验证超300 500 bp。NA 分成三份，Input 组 1ug，IP 组和 IgG 组各水中，99 煮沸 10min 使 DNA 变性。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

【参考文献】