肿瘤酸性微环境对人乳腺癌肿瘤细胞干性及糖代谢作用及机制的研究

发布时间：2017-03-26 00:11

  本文关键词：肿瘤酸性微环境对人乳腺癌肿瘤细胞干性及糖代谢作用及机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肿瘤干细胞是一群具有高抗放化疗特性,能够进行自我更新,自我修复,保持有一定的全能性,并且具有多向分化潜能,能够在体外形成克隆的一群比例极小的细胞亚群,目前被认为是造成肿瘤复发转移的根源之一 肿瘤干细胞干性的维持需要其所处的微环境的支持。肿瘤微环境可以保证肿瘤干细胞处于静息与未分化状态,维持肿瘤干细胞增殖与分化的潜能。酸性微环境是所有肿瘤组织的共性,大量的研究证实,恶性肿瘤组织周围的pH值在6.9-6.0之间,甚至更低达到5.8。而正常组织周围的pH值一般稳定保持在7.35-7.45之间。长期以来人们认为酸性微环境是低氧微环境所造成的,而忽略了肿瘤细胞独特的代谢表型——瓦伯格效应(Warburg Effect),即肿瘤细胞无论是在有氧还是低氧环境下都进行糖酵解反应,从而产生大量的乳酸,造成氢离子外排,进而形成了酸性微环境。 Lin28是一类从低等生物到高等生物都高度保守的RNA结合蛋白。最近的研究发现,Lin28能够促进细胞重编程从而维持干细胞的自我更新能力和多能性,然而Lin28调节干细胞的分子机制并不十分清楚。Lin28作为RNA结合蛋白,可以参与抑制一些nicroRNAs的加工成熟,使得Lin28成为转录后水平调控细胞命运的关键分子。 之前人们主要的研究方向都放在了低氧微环境对于肿瘤干细胞干性的维持上,鲜有文献报道酸性微环境对于肿瘤干细胞干性的影响以及代谢与干性维持之间的关系。Lin28在调节肿瘤干细胞干性与代谢相互作用之间的分子机制也并不十分明确。 本研究为了明确有氧糖酵解代谢所产生的酸性微环境对于肿瘤干细胞的影响,分别在pH6.8和7.4的环境下,培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231。利用流式细胞术检测肿瘤干细胞ALDHhigh细胞亚群的变化情况；在DNA水平和蛋白质水平,检测干性基因SOX2、OCT4、Lin28b的表达情况；利用体外成球实验,检测成球能力的差别；利用划痕实验,检测肿瘤细胞迁移能力的改变情况。同时通过PCR、WesternBlot检测相关信号通路TCF4/β-catenin的激活情况,探究酸性微环境对于肿瘤干细胞影响的可能作用机制。 结果显示,酸性微环境可以通过激活TCF4/β-catenin信号通路上调Lin28b表达,提高MDA-MB-231的ALDHhigh细胞亚群的比例,上调干性相关基因的表达,增强体外成球能力和迁移能力。 为了明确干性与有氧糖酵解相互作用的关系,建立敲低干性关键分子Lin28b的MDA-MB-231稳定细胞系,在DNA水平和蛋白质水平,检测有氧糖酵解相关基因(GLUT1, PKM2, LDHA,PDK1)的表达；利用Cell Titer-Blue Cell Viability Assay试剂盒,检测细胞ATP生成量；通过PCR筛选与Lin28b相关microRNAs的表达,探究Lin28b调节代谢的可能作用机制。 结果显示,干性关键分子Lin28b可以通过下调miR-34a-5p,从而促进有氧糖酵解相关基因的表达,下调细胞ATP的生成。 为了明确有氧糖酵解代谢所产生的酸性微环境对于肿瘤细胞代谢的影响。分别在pH6.8和7.4的环境下,培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231。在DNA水平和蛋白质水平,检测有氧糖酵解相关基因(GLUT1,PKM2,LDHA,PDK1)和miR-34a-5p的表达；利用Cell Titer-Blue Cell Viability Assay试剂盒,检测细胞ATP生成量。同时利用TCF4/β-catenin/Lin28b信号通路抑制剂,检测信号通路阻断后有氧糖酵解相关基因(GLUT1,PKM2,LDHA,PDK1)的表达情况。 结果显示,酸性微环境可以通过激活TCF4/β-catenin信号通路上调Lin28b,从而下调miR-34a-5p,进而显著上调有氧糖酵解相关基因的表达,同时明显下调细胞ATP的生成量。 通过以上实验结果,我们主要得到了以下结论：酸性微环境可以激活TCF4/β-catenin信号通路,上调Lin28b的表达,从而一方面提高MDA-MB-231细胞的干性,维持肿瘤干细胞表型；另一方面通过下调miR-34a-5p,从而促进有氧糖酵解相关基因(GLUT1,PKM2,LDHA,PDK1)的表达,下调细胞ATP的生成,促进糖酵解反应,加速乳酸的生成和氢离子的外排,从而进一步促进酸性微环境的形成。本研究为深入认识肿瘤酸性环境与肿瘤细胞的干性以及代谢特征之间的相互关系进行了有意义的探索。
【关键词】：乳腺癌 肿瘤干细胞 酸性微环境 有氧糖酵解 Lin28b
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 目录3-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 中英文缩略表10-11
• 前言11-21
• 第一节 癌症复发新力量：肿瘤干细胞及其微环境11-15
• 1. 肿瘤干细胞的分离与鉴定12-13
• 2. 肿瘤干细胞与肿瘤微环境13-14
• 3. RNA结合蛋白Lin28与肿瘤干细胞14-15
• 第二节 新的肿瘤研究思路：异常代谢的结果15-18
• 1. 肿瘤细胞的代谢特点15-17
• 2. 代谢型与干性维持的关系17-18
• 第三节 肿瘤治疗的新视野18-19
• 1. 传统的靶向癌基因策略18-19
• 2. 肿瘤治疗的新靶向19
• 第四节 本课题的假设和研究目的及意义19-21
• 材料与方法21-36
• 第一节 实验材料21-24
• 1. 仪器设备21-22
• 2. 菌株、细胞系和载体22
• 3. 实验试剂22-24
• 第二节 溶液的配置24-27
• 1. 细胞培养基和有关溶液24-25
• 2. DEPC处理水(1L)25
• 3. 10×PBS(1L)25
• 4. 大肠杆菌培养基的配制25
• 5. SDS-PAGE溶液配制25-26
• 6. DNA电泳缓冲液配制(10×TBE)26
• 7. Western Blotting相关溶液26-27
• 第三节 实验方法27-36
• 1. 细胞培养27-28
• 2. Western Blot28-30
• 3. RT-PCR和Real-time PCR30-32
• 4. 启动子双荧光报告质粒的构建32-34
• 5. 细胞转染34
• 6. 荧光素酶活性检测34-35
• 7. 细胞划痕实验和体外成球实验35
• 8. 流式细胞术35
• 9. 数据统计35-36
• 实验结果36-57
• 第一节 肿瘤酸性微环境对人乳腺癌肿瘤干细胞的影响36-42
• 1. 肿瘤酸性微环境增加人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 ALDH~(high)细胞群比例36-37
• 2. 肿瘤酸性微环境上调人乳腺癌细胞系MDA-MB-231干性基因的表达37-39
• 3. 肿瘤酸性微环境提高人乳腺癌细胞系MDA-MB-231体外成球能力39-40
• 4. 肿瘤酸性微环境增强人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的迁移能力40-42
• 第二节 肿瘤酸性微环境通过TCF4/β-catenin/Lin28b通路调节人乳腺癌肿瘤细胞干性42-47
• 1. Lin28b可以调节干性基因的表达42-43
• 2. 敲低Lin28b可以阻断酸性微环境诱导的干性基因的表达上调43-44
• 3. 肿瘤酸性微环境激活TCF4/β-catenin信号通路44-45
• 4. TCF4/β-catenin复合体可以在转录水平上调节Lin28b45-47
• 第三节 干性对于人乳腺癌肿瘤细胞有氧糖酵解的影响47-53
• 1. 肿瘤干细胞亚群ALDH~(high)有氧糖酵解相关基因表达上调47
• 2. 敲低Lin28b的表达可以下调人乳腺癌细胞有氧糖酵解相关基因的表达47-48
• 3. 敲低Lin28b的表达可以增强人乳腺癌肿瘤细胞胞内ATP的生成48-49
• 4. 敲低Lin28b的表达可以上调miR-34a-5p的表达49-50
• 5. 过表达miR-34a-5p可以下调有氧糖酵解相关基因的表达50-51
• 6. 抑制miR-34a-5p的表达可以上调有氧糖酵解相关基因的表达51-53
• 第四节 肿瘤酸性微环境对人乳腺癌肿瘤细胞有氧糖酵解代谢的影响53-57
• 1. 肿瘤酸性微环境可以通过下调miR-34a-5p上调有氧糖酵解相关基因的表达53
• 2. 肿瘤酸性微环境可以上调缺氧诱导因子HIF1α的表达53-55
• 3. 肿瘤酸性微环境下人乳腺癌肿瘤细胞胞内ATP的生成量降低55
• 4. 抑制TCF4/β-catenin/Lin28b信号通路可以显著下调有氧糖酵解相关基因的表达55-57
• 讨论57-61
• 总结61-62
• 参考文献62-68
• 个人简历68-69
• 致谢69-70

【共引文献】

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