LncRNA在CRC组织中的表达特征和GAPLINC在CRC发生发展中的作用机制

发布时间：2020-05-25 18:44

【摘要】：目的:结直肠癌(CRC)是发病率较高的肿瘤之一,为提高治疗效果,寻找结CRC的早期诊断标志物或分子靶标显得尤为重要。长链非编码RNA(lncRNA)是非编码RNA中的一类,与许多疾病有关,尤其与肿瘤的发生发展有关。己有初步研究表明lncRNAGAPLINC与肿瘤发生发展有关。本研究将利用公共数据库的RNA序列(RNA-seq)数据资源,分析lncRNA在CRC组织中的表达特征及其在预后判断方面的潜在价值,并进一步研究GAPLINC在CRC发生发展过程的作用机制,探讨其潜在的临床应用价值。方法:下载肿瘤基因图谱(TCGA)数据库中CRC相关的RNA-seq数据,进行lncRNA表达差异、功能、通路富集及调控网络分析,同时分析lncRNA差异表达对CRC患者预后的影响;利用lncRNAPCR芯片筛选3对CRC标本的癌组织和对应的癌旁组织差异表达的lncRNA;确定目标lncRNA GAPLINC后,对21对临床标本进行验证;培养CRC株(HCT116),构建GAPLINC表达质粒和合成siRNA转染HCT116细胞,研究其对HCT116细胞迁移、侵袭及凋亡的影响;核质分离实验确定GAPLINC在细胞质和细胞核的表达情况,生物信息学方法预测与GAPLINC结合的miRNA,RNA pull-down及荧光素酶报告基因实验确定目标miRNA,并对21对临床标本验证其相关性,同时构建目标miRNA mimics转染HCT116细胞,观察其对肿瘤细胞迁移、侵袭能力及细胞凋亡的影响;通过生物信息学方法预测目标miRNA调控靶基因,RT-qPCR和WB检测抑制GAPLINC和增加miR-34a的表达对靶基因表达的影响;同时通过RT-qPCR检测21对临床标本的靶基因与目标miRNA和GAPLINC表达的相关性。结果:对TCGA数据进行分析,结果提示有119个lncRNA存在差异性表达,lncRNA和编码基因(coding gene)存在共表达关系,对基因富集性分析发现,lncRNA参与细胞的多个生物学行为,lncRNA-miRNA-mRNA存在密切的调控网络,其中16个lncRNA对患者生存预后显著相关。LncRNAPCR芯片结果表明,CRC组织中存在较多的lncRNA表达异常,其中GAPLINC在CRC中表达表达量显著高于正常对照组织;21对临床标本也证实CAPLINC在肿瘤组织的表达量显著高于癌旁正常组织;培养HCT116细胞,GAPLINC的过度表达可增加HCT116细胞的迁移和侵袭能力,同时抑制细胞凋亡,抑制GAPLINC的表达则出现相反的现象;核质分离实验表明GAPLINC主要表达于细胞质后,根据生物信息学方法预测10个可能与GAPLINC结合且与CRC发病相关的miRNA,RNApull-down和荧光素酶报告基因实验证实miR-34a为目标miRNA;21对临床样本RT-qRCR亦证实GAPLINC与miR-34a的表达显著负相关;将miR-34 mimics转染HCT116细胞或与GAPLINC表达质粒共同转染HCT116细胞,结果表明miR-34a mimics可降低肿瘤细胞的迁移及侵袭能力,抵消部分GAPLINC的作用;预测miR-34a靶基因,确定c-MET为miR-3a调控的靶基因,HCT116细胞转染GAPLINC siRNA和miR-34a mimics后均可使c-MET的表达量降低;临床标本证实miR-34a与c-MET的表达显著负相关,同时GAPLINC与c-MET的表达呈显著正相关。结论:生物信息学分析显示lncRNA在CRC发生发展过程中起着重要作用,参与多个生物学行为,对CRC患者预后判断及实验设计具有一定指导意义;其中GAPLINC其具有促进CRC细胞的迁移、侵袭,同时抑制细胞凋亡的作用,从而发挥其致癌作用;其主要作用机制为通过竞争性结合miR-34a,进而影响c-MET的表达,实现对肿瘤发生发展的调控,在CRC诊断及靶向治疗等方面具有潜在的临床意义。
【图文】：

序列,编码能力,短肽,编码区

前言逡逑（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，，邋ｎｔ），其具有与编码ＲＮＡ基因类似的特征，如ＲＮＡ多聚酶ＩＩ介导转逡逑录、５’端帽、剪切加工、多个外显子、３’多聚腺苷酸（ｐｏｌｙ－Ａ）、转录位置的组蛋逡逑白邋３邋第邋４邋位赖氨酸邋３邋甲基化（ｈｉｓｔｏｎｅ邋３，邋ｌｙｓｉｎｅ邋４邋ｔｒｉ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，Ｈ３Ｋ４邋ｍｅ３）等，但逡逑其与编码ＲＮＡ基因存在若干差异，如缺少编码区或编码区长度比较短；缺少开逡逑放阅读框架（ｏｐｅｎ邋ｒｅａｄｉｎｇ邋ｆｒａｍｅｓ，邋ＯＲＦｓ），或ＯＲＦｓ无功能性；不包含己知蛋白结逡逑构域或基因序列内不存在蛋白数据库记录的类似序列片段等。然而，ＩｎｃＲＮＡ并逡逑非无任何编码能力，部分ＩｎｃＲＮＡ可表现为低编码能力，可翻译成少量的短肽，逡逑或翻译的短肽被迅速降解？Ｇ］。基于传统的理论和大部分转录启动的情况，逡逑ＩｎｃＲＮＡ被认为是无效的转录，是ＤＮＡ转录的“噪点”［１Ｕ２］。但目前已有研究表逡逑明，ＩｎｃＲＮＡ结构复杂，功能较为丰富，在调控基因表达方面起着重要作用，其逡逑种类包括基因组间ＩｎｃＲＮＡ、内含子（基因内）ＩｎｃＲＮＡ、顺式或反式ＩｎｃＲＮＡ（图逡逑１）。逡逑

诱导分子,机制,竞争性,内源

博士学位论文逦逡逑显得微不足道，其吸附ｍｉＲＮＡ的量也有限，最终对ｍＲＮＡ的翻译造成多逡逑响仍有待探讨［３３］。然而，ＩｎｃＲＮＡ的ＣｅＲＮＡ现象在肿瘤细胞中广泛存在，逡逑明很多肿瘤的发病机制，因此，目前ＩｎｃＲＮＡ的ＣｅＲＮＡ作用机制仍是主要逡逑热点之一。逡逑综上所述，ＩｎｃＲＮＡ的功能复杂，并非ＤＮＡ的无效转录，其主要作用机制如逡逑图所示。逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

【相似文献】