多靶点抗肿瘤天然活性成分筛选及其抑瘤活性研究

发布时间：2017-03-26 05:09

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【摘要】：本论文重点围绕多靶点抗肿瘤天然活性成分的筛选及抗肿瘤机制开展研究,构建EGFR、TNFR, Fas多靶点脂筏色谱模型,提取北葶苈子中具有抗肿瘤活性的部位。研究抗肿瘤活性部位体外抑制乳腺癌MCF-7细胞株增殖、促进凋亡、调控周期及抑制迁移的机理。分析北葶苈子抗肿瘤活性部位体内的急性毒性,同时探讨其体内抑制乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤生长的机理。主要分为以下五个部分： 第一章多靶点脂筏亲和色谱概述及中药抗肿瘤概述 对脂筏亲和色谱的研究进展进行了综述,充分调研了脂筏亲和色谱的研究现状,阐述了多靶点脂筏亲和色谱的构建原理；分别基于中医传统理论及现代分子生物学角度对中药抗肿瘤机制进行了综述。同时,阐述了本文研究对象,即北葶苈子的研究现状,提出了本论文的研究目的、研究展望及实验方案的设计,为论文实验工作的顺利进行奠定了理论基础。 第二章多靶点脂筏色谱的构建及北葶苈子抗肿瘤活性部位的筛选 构建了富含表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)和凋亡相关蛋白因子(Fas)的新型多靶点脂筏色谱,为实现多靶点、快速、在线筛选中药抗肿瘤活性成分奠定了基础。将多靶点脂筏色谱技术应用于北葶苈子各部位抗肿瘤活性的筛选,采用MTT法对北葶苈子水饱和正丁醇萃取部位进行抗肿瘤活性研究。 从人乳腺癌MCF-7细胞株提取富含EGFR、TNFR、Fas的脂筏,制备硅胶固定相并与脂筏连接,构建多靶点脂筏色谱。制备CdTe量子点并与EGFR、TNFR和Fas一抗偶联后对脂筏色谱进行鉴定。采用多靶点脂筏色谱筛选北葶苈子的水提液、乙醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水饱和正丁醇萃取部位及萃余部分的抗肿瘤活性部位。该活性部位以0.05μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL分别作用于人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株HepG-2、人胃癌细胞株SGC和小细胞肺癌SCLC细胞株,72h后MTT法检测其对四种肿瘤细胞生长的作用。此外,该活性部位及5-Fu分别以浓度1μg/mL、5μg/mL、101μg/mL、251μg/mL、50μg/mL作用于大鼠成纤维细胞,MTT法考察该活性部位及5-Fu对大鼠成纤维细胞的毒性。结果表明：北葶苈子水饱和正丁醇萃取部位7.02-18.66min在多靶点脂筏色谱柱上有保留行为,表明该部位具有抗肿瘤活性。MTT法检测水饱和正丁醇萃取部位对MCF-7细胞株的抑制效果(IC50为0.77μg/mL)优于HepG2(IC50为1.55μg/mL)、SGC(IC50为5.49μg/mL)和SCLC(IC50为6.09μg/mL)细胞株。水饱和正丁醇萃取部位对大鼠成纤维细胞的毒性较小。 第三章北葶苈子活性部位抑制人乳腺癌MCF-7细胞株机制的研究 从抑制增殖、促进凋亡、调控周期、抑制迁移四个方面对北葶苈子活性部位的体外抗肿瘤机制进行了系统全面的研究。Western blot及免疫荧光法检测了增殖相关的ERK磷酸化活性、凋亡相关的Bcl-2和Bax蛋白的表达、细胞周期蛋白PCNA的表达；采用流式细胞技术对MCF-7细胞株的早期凋亡和周期进行了分析；采用DNA Ladder(?)口transwell技术研究了MCF-7细胞株的凋亡及其迁移。 Western blot及免疫荧光法检测了北葶苈子活性部位对ERK磷酸化活性的作用,结果表明：其明显抑制了ERK磷酸化的活性,且随浓度的增加,抑制作用明显增强。由此推测,北葶苈子活性部位对MCF-7细胞株的抑制增殖作用是通过抑制ERK介导的MAPK信号通路而实现的。 通过Western blot检测了北葶苈子活性部位对Bcl-2和Bax蛋白的作用,结果表明：北葶苈子活性部位作用于MCF-7细胞株24h后,对Bcl-2表达的抑制作用和对Bax表达的促进作用均呈现出剂量依赖性,说明其在24h时促进MCF-7细胞株凋亡是通过调控Bcl-2家族的表达来实现的。AnnexinV/PI双染检测细胞早期凋亡发现,北葶苈子活性部位可以明显增加MCF-7细胞株的早期凋亡,且具有时间剂量依赖关系。DNA Ladder研究北葶苈子活性部位及5-Fu对MCF-7细胞株凋亡的作用,结果表明：活性部位及5-Fu作用72h后,低、中、高三个浓度均可看到明显的梯形条带。 流式细胞技术分析北葶苈子活性部位对MCF-7细胞株周期影响的结果显示,空白对照组S期细胞所占比例较高,提示MCF-7细胞株DNA合成活跃,肿瘤增殖性强。北葶苈子活性部位高浓度使MCF-7细胞株G0/G1期细胞的比例明显增加,而S期MCF-7细胞所占的比例明显下降,且有剂量依赖关系,表明其将MCF-7细胞株阻滞于G0/G1期,造成了G1期细胞堆积阻滞。Western blot及免疫荧光法分析PCNA蛋白的表达,北葶苈子活性部位的低浓度给药组在不同时间点均对PCNA的表达无明显抑制作用,而中、高浓度组则能明显抑制PCNA的表达,从而干扰MCF-7细胞S期DNA的合成,降低了S期细胞所占比例。 采用transwell法检测了北葶苈子活性部位及5-Fu对MCF-7细胞株迁移的作用。结果表明：北葶苈子活性部位组及5-Fu组均能明显抑制MCF-7细胞株的迁移,且均呈时间剂量依赖关系。相同浓度的北葶苈子活性部位组与5-Fu组两者对细胞迁移的抑制作用无明显差异。 第四章北葶苈子活性部位急性毒理学研究 采用急性毒性分类法、改良寇氏法评价北葶苈子活性部位经口、经腹腔急性毒性作用。计算了北葶苈子活性部位经口／腹腔的LD50,为其裸鼠移植瘤抑制作用的研究提供了剂量依据；通过计算北葶苈子活性部位经口／腹腔的脏器系数,评价其急性毒性。 急性毒性分类法结果表明：北葶苈子活性部位按2000mg/kg的剂量对小鼠灌胃给药的LD5o约为4000～5000mg/kg,为低毒物质。改良寇氏法计算腹腔注射给药的LD5o,结果显示：小鼠腹腔注射给药的LD5o为505.36mg/kg, LD50的95%平均可信限为590.32mg/kg～432.61mg/kg。北葶苈子活性部位腹腔注射剂量低于250mg/kg时,无急性毒性,为低毒物质。 第五章北葶苈子活性部位对裸鼠MCF-7移植瘤抑制作用的研究 构建了人乳腺癌MCF-7细胞株裸鼠移植瘤模型,对北葶苈子活性部位经口、经腹腔的体内抑瘤活性进行了评价。采用Western blot检测了Bcl-2和Bax蛋白的表达,对北葶苈子活性部位的体内抗肿瘤机制进行了初步探讨。 裸鼠背部右侧皮下接种MCF-7细胞株建立移植瘤模型,北葶苈子活性部位按100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg口服给药；按25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg腹腔注射给药；5-Fu腹腔注射给药20mg/kg,治疗4周。治疗结束后剥离瘤块,测量瘤块体积并称重。采用Western blot对Bcl-2及Bax蛋白的表达进行检测。结果表明：北葶苈子活性部位经口服给药、腹腔注射给药及5-Fu对瘤块体积和重量均有明显抑制作用(P0.05)。Western blot检测北葶苈子活性部位组及5-Fu组均明显降低了Bcl-2蛋白的表达,增加了Bax蛋白的表达(P0.05)。北葶苈子活性部位腹腔注射给药组对Bcl-2的抑制作用有剂量依赖关系。
【关键词】：多靶点 脂筏色谱 北葶苈子 MCF-7 抗肿瘤机制 急性毒性
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要7-11
• ABSTRACT11-19
• 英文缩写索引19-20
• 第一章 多靶点脂筏亲和色谱概述及中药抗肿瘤概述20-38
• 1.1 乳腺癌研究现状20-21
• 1.2 多靶点脂筏亲和色谱概述21-30
• 1.2.1 中药活性成分筛选的传统方法21
• 1.2.2 细胞膜亲和色谱筛选模式21-22
• 1.2.3 多靶点脂筏色谱筛选模式22-30
• 1.3 中药抗肿瘤机制的概述30-35
• 1.3.1 中药抗肿瘤机制的研究30-34
• 1.3.2 中药葶苈子的研究现状34-35
• 1.4 本论文的研究目的、研究展望及实验方案的设计35-38
• 1.4.1 研究目的35
• 1.4.2 研究展望35
• 1.4.3 本论文研究方案35-38
• 第二章 多靶点脂筏色谱的构建及北葶苈子抗肿瘤活性部位的筛选38-56
• 2.1 材料和方法39-44
• 2.1.1 材料39-41
• 2.1.2 方法41-44
• 2.2 实验结果44-52
• 2.2.1 CdTe量子点荧光光谱的测定44-45
• 2.2.2 脂筏及其固定相的鉴定结果45-46
• 2.2.3 北葶苈子活性部位的筛选46-48
• 2.2.4 水饱和正丁醇萃取部位对肿瘤细胞的抑制作用48-51
• 2.2.5 水饱和正丁醇萃取部位对成纤维细胞的毒性作用51-52
• 2.3 讨论52-56
• 第三章 北葶苈子活性部位抑制人乳腺癌MCF-7细胞株机制的研究56-74
• 3.1 材料和方法57-63
• 3.1.1 材料57-59
• 3.1.2 方法59-63
• 3.2 结果63-71
• 3.2.1 Western blot检测ERK磷酸化、Bcl-2及Bax的表达63-65
• 3.2.2 免疫荧光检测p-ERK、Bcl-2及Bax的表达65-66
• 3.2.3 流式细胞术检测MCF-7细胞株的早期凋亡66-68
• 3.2.4 DNA Ladder分析MCF-7细胞株的凋亡68
• 3.2.5 流式细胞术检测MCF-7细胞株周期的变化68-69
• 3.2.6 Western blot检测PCNA蛋白的表达69-70
• 3.2.7 Transwell检测MCF-7细胞株的迁移能力70-71
• 3.3 讨论71-74
• 第四章 北葶苈子活性部位急性毒理学研究74-84
• 4.1 急性毒性实验概述74-78
• 4.1.1 急性毒性分类法74-75
• 4.1.2 上下增减量法75-76
• 4.1.3 固定剂量法76-77
• 4.1.4 三种方法的比较77-78
• 4.1.5 改良寇氏法计算LD_(50)78
• 4.2 材料与方法78-80
• 4.2.1 实验动物78
• 4.2.2 实验动物的饲养78
• 4.2.3 实验方法78-80
• 4.2.3.1 样品的制备78-79
• 4.2.3.2 经口急性毒性试验79
• 4.2.3.3 腹腔注射给药急性毒性试验79
• 4.2.3.4 寇氏法计算LD_(50)79-80
• 4.2.3.5 计算LD_(50)的95%平均可信限(CL)80
• 4.2.3.6 脏器系数计算80
• 4.2.3.7 统计学分析80
• 4.3 实验结果80-82
• 4.3.1 经口急性毒性试验80-81
• 4.3.2 腹腔注射给药急性毒性试验81-82
• 4.4 讨论82-84
• 第五章 北葶苈子活性部位对裸鼠MCF-7移植瘤抑制作用的研究84-94
• 5.1 材料和方法84-88
• 5.1.1 材料84-86
• 5.1.1.1 细胞株及裸鼠84
• 5.1.1.2 主要试剂84-85
• 5.1.1.3 主要仪器85
• 5.1.1.4 主要溶液85-86
• 5.1.2 方法86-88
• 5.1.2.1 MCF-7细胞的培养86-87
• 5.1.2.2 裸鼠模型建立87
• 5.1.2.3 分组及药物处理87
• 5.1.2.4 观察指标与取材87-88
• 5.1.2.5 组织蛋白的提取88
• 5.1.2.6 Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白的表达88
• 5.1.2.7 统计学方法88
• 5.2 实验结果88-92
• 5.2.1 MCF-7裸鼠移植瘤88-89
• 5.2.2 移植瘤的重量和体积89-91
• 5.2.3 Western blot检测Bcl-2和Bax的表达91-92
• 5.3 讨论92-94
• 第六章 全文总结94-97
• 6.1 主要结论94-95
• 6.2 创新点95-97
• 参考文献97-115
• 致谢115-116
• 攻读博士学位期间发表的文章及专利116-117

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